실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
큰size 단백질의 western blot 질문입니다..도와주세요..ㅠㅠ
western ㅠㅠ (비회원)
안녕하세요, 석사1학기 학생입니다.. ^-^;; western blot을 하고있는데요.. 맨 처음단계부터 어렵게!!어렵게!! 조건을 잡아서 열심히 실험중에 있습니다.. 제가 지금까지 봐왔던 단백질 사이즈는 약 70~75KDa정도 이구요.. 12% gel에서 SDS-PAGE 하고,, transfer는 NC membrane사용 / 100V / 1hr (BIO-RAD 탱크타입) 으로 했습니다. transfer 후, 폰슈염색해서 단백질들이 잘 옮겨가있는것을 확인했구요.. 70~75KDa정도의 size는 western 결과도 아주 잘 나왔습니다.. 그런데 문제는.... 위와 같은 조건으로 했을 때 90~100KDa 정도의 사이즈와 380KDa 정도의 사이즈는 계속 결과가 나오지 않는다는 것입니다. 그래서 gel %도 5% / 8% / 10% / 12% 로 바꿔가면서 사용도 해보고,,, transfer 조건도 100V 1hr / 100V 2hr / 35V over night 으로 바꿔가며 실험해보았습니다... 브릭사이트를 뒤져가며 거의 모든 방법으로 실험을 해보았지만...결과가 나오지 않습니다.... 사이즈가 너무커서 transfer가 되지 않은것인지.... 아니면 다른 문제가 있는건지....... 도무지 알수가 없습니다.....ㅠㅠ 90~100KDa 정도의 사이즈와 380KDa 정도의 사이즈의 단백질을 대상으로 실험해보신분 계시면 방법좀 알려주세요....ㅠㅠ 너무너무 감사드립니다....ㅠㅠ
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