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BioLab 정래동 교수
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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 9991  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 큰size 단백질의 western blot 질문입니다..도와주세요..ㅠㅠ
western ㅠㅠ  | 2008.08.05 19:14
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
안녕하세요, 석사1학기 학생입니다.. ^-^;;

western blot을 하고있는데요..
맨 처음단계부터 어렵게!!어렵게!! 조건을 잡아서 열심히 실험중에 있습니다..


제가 지금까지 봐왔던 단백질 사이즈는 약 70~75KDa정도 이구요..

12% gel에서 SDS-PAGE 하고,,

transfer는 NC membrane사용 / 100V / 1hr (BIO-RAD 탱크타입) 으로 했습니다.

transfer 후, 폰슈염색해서 단백질들이 잘 옮겨가있는것을 확인했구요..

70~75KDa정도의 size는 western 결과도 아주 잘 나왔습니다..


그런데 문제는....

위와 같은 조건으로 했을 때 90~100KDa 정도의 사이즈와 380KDa 정도의 사이즈는 계속 결과가 나오지 않는다는 것입니다.

그래서 gel %도 5% / 8% / 10% / 12% 로 바꿔가면서 사용도 해보고,,,

transfer 조건도 100V 1hr / 100V 2hr / 35V over night 으로 바꿔가며 실험해보았습니다...

브릭사이트를 뒤져가며 거의 모든 방법으로 실험을 해보았지만...결과가 나오지 않습니다....


사이즈가 너무커서 transfer가 되지 않은것인지.... 아니면 다른 문제가 있는건지.......
도무지 알수가 없습니다.....ㅠㅠ


90~100KDa 정도의 사이즈와 380KDa 정도의 사이즈의 단백질을 대상으로 실험해보신분 계시면 방법좀 알려주세요....ㅠㅠ


너무너무 감사드립니다....ㅠㅠ
#western blot
 
# transfer
 
# 큰size protein
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리ryan  |  2008.08.05   
size 90~100kDa정도는 8%정도의 gel로 내린후 1시간 transfer하시면 됩니다.
transfer시 전류는 단백질 size에 관련되서 변화를 주는 것이 아니라 전체적인 gel size에 대해 바뀌는 것입니다. 가로x세로x0.8+10mA를 기본적으로 사용하는 것으로 알고 있습니다.

사이즈 380kDa은 잡아본 적이 없지만 240을 잡은 기억으로는 8%gel로 하고, transfer는 2시간정도 한것 같습니다. 역시 전류는 일정하고요,
marker가 380kDa부근을 가르키는 size가 있다면, 그것이 transfer되었는지 확인해보세요.

좋은 결과 있으시길 바랍니다^^
개구리방랑범생  |  2008.08.06   
97Kda으로 Western을 해봤습니다만 저 같은 경우 12% gel을 사용 했고 transfer는 50V로 O/N 했습니다. 저 역시 Tank type이었구요..

90~100Kda도 size가 큰 편인데 380Kda이면 로딩했을 경우 comb을 빠져 나왔을 지도 살짝 의문이네요.. 제 생각엔 380Kda정도면 다른 protein보다 시간을 1.5배~2배가량의 시간을 더 두고 로딩을 해야 Gel 상에서 밴드가 확인이 될 것 같네요.

로딩 시간에 관해서는 정보가 없어서.. 혹시나 하는 맘에 글을 올려봅니다.
western ㅠㅠ  |  2008.08.07    
자세한 설명 너무너무 감사드립니다!!!!

밴드가 조금씩 조금씩 보이기 시작했어요!@@@@!!!!ㅋㅋ ^-^

이제 조금만 더 조건을 잡으면 될 것 같습니다.!!!

너무너무 감사드립니다!!!! ^-^

오늘은 기분이 날아갈 것 같습니다!!!!ㅎㅎㅎㅎ^-^ 감사합니다!!! ㅎㅎ
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