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레벨3
goviral
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18.08.13 18:38
1. 그 정도 차이면 문제가 될 것 같지 않습니다만, 300ng을 사용하시는게 더 효율적이지도 않을 것 같습니다. 100ng으로 설정을 해 놓은 데에는 RT 과정에 사용되는 RTase와 rNTPs의 농도의 한계라던지, 이후 PCR과정에 사용될 DNA template의 양이 너무 많지 않도록 제한한 것이 아닐까 생각되네요.
2. 얼마나 적은 copy number를 사용하시는지 모르겠으나, 아무래도 sample 내 존재하는 RNA 양이 적을 경우, replicates간 variation이 생길 확률은 높을 것 같습니다. 다만 제 경험에는, CT 값이 아예 검출이 안 되거나 검출이 되거나 하지, detection limit 이상 RNA가 존재하는 경우, 검출된 CT값 간의 variation은 대부분 pipetting error에 의한 것으로 보입니다.
3. 48도 30분은 reverse-transcription 과정을 위한 것으로 이 과정은 없애시면 cDNA가 만들어지지 않기 때문에 PCR을 하셔도 detection이 불가능합니다.
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대학원생111
(비회원)
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18.08.13 21:43
하마터면 RT PCR 이 아닌 엉뚱한 것을 할 뻔 했네요,
조언 주셔서 감사합니다.