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질문 ELISA coating 관련해 질문드립니다
알석사꾸러기(과기인)  | 2018.08.13 15:47
ELISA plate coating을 진행하고 있는 학생입니다. 

기존에 사용하고 있는 ELISA kit에서 capture Ab만을 변형해 assay를 진행하고있습니다. 

이 때 저희가 보고자 하는 Ab를 plate에 coating하고 그 이후에 사용되는 detection Ab,

substrate는 모두 기존 ELISA kit의 방법을 이용했습니다.

근데 ELISA kit 안에 있던 standard를 sample로 하여 assay를 측정하였을 때

기존에 측정된 값과 비교해 값이 너무 낮게 나와 protocol 상의 문제가 있는건지

잘 모르겠습니다ㅠㅠㅠ 

(예를 들어, 기존 kit에서 40ng/ml에서 나오던 값이 0.3417이였으면
                   coating한 plate에서는 0.0036이 나왔습니다ㅠㅠ)

고수님들께서는 어떻게 하셨는지 조언부탁드립니다. 

<실험 protocol>
1. Plate에 coating하고자 하는 Ab를 100ul 분주
(이 때, Ab는 0.5u/ml, 1ug/ml, 5ug/ml, 10ug/ml로 다양한 농도로 만든 후 분주하였습니다.
어떠한 농도 값에서 coating이 잘되고 detection이 잘 되는지 몰라 다양한 농도로 진행했습니다.)
→ 37℃, O/N
2. Washing
→ 1x PBS, 200ul, 3times
3. Blocking
→ 5% BSA ( in 1x PBS, 0.5% Tween 20)
→ RT, 2hr
4. Washing
→ 1x PBS, 200ul, 5times
…………………………………………………… 이후 부터는 기존에 사용하던 ELISA kit 방법입니다.
5. Loading
→ sample 10ul ,Buffer 100ul
→ 37℃, O/N
6. Washing
→ Washing buffer, 200ul, 3times
7. Conjugate
→ Conjugate buffer, 100ul
→ RT, 2hr
8. Washing
→ Washing buffer, 200ul, 5times
9. Substrate
→ Substrate buffer, 100ul
→ RT, 30min, dark condition
10. Stop & reading
→ Stop solution, 100ul
→ OD450nm

실험에 사용했던 protocol입니다ㅠ 

확인해 보시고 많은 조언부탁드립니다!!! 



















#ELSIA
 
#ELSIA plate coating
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리후르망  |  2018.08.13   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
항상 kit 처럼 나올 수는 없어요.
standard curve 를 그려봐서 잘나오면 잘된걸로 판단될 거같아요.
올챙이naregi  |  2018.08.13   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

capture coating하실때 버퍼조성이 어떻게 되세요 ?

알석사꾸러기  |  2018.08.14   
ELISA coating buffer는 

R&D system회사 제품 (cat no.: DY006)을 사용했습니다. 

멸균 필터링한 PBS라고 나와있습니다ㅠㅠ

 
앞다리오치  |  2018.08.14   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
제 경험과 비슷한 경우인 것 같아서 추가 답변 드립니다.

kit를 이용하여 ELISA 진행 시 저는 보통 RnD 제품을 많이 이용하였는데

이 때, BSA를 제작해서 쓴다던지 substrate를 타제품의 TMB를 사용하여 진행하였었는데

이 때에도 kit에서 제공하는 standard OD값보다 굉장히 낮은 값을 detection 하였습니다.

그래서 BSA와 substrate를 RnD 자사품으로 바꾸고나서 비교 실험해봤는데

kit에서 제공하는 standard OD값과 유사하게 나왔습니다.

아마도 실험자님께서 kit에서 제공하는 buffer 의외에 제작이나 타제품을 이용하셨을텐데...

비슷한 경우가 아닐까 싶습니다.

만약 RnD 제품을 쓰신다면 지금 제가 진행하는 protocol은 kit에서 제공하는 방법을 따라하고

blocking 과정과 sample 희석과정에서만 자체 제작한 1% BSA(in PBS)를 사용하며

나머지 detection antibody나 HRP step 자사제품인 BSA를 사용하며

마지막 substrate 역시도 자사제품을 사용합니다.

그렇게 했더니 standard OD값이 kit에서 보여주는 값과 유사하게 나왔습니다.

한 번 kit 자사제품과 제작 및 타사 제품의 buffer를 잘 조합해보시길 바랍니다.

좋은 실험결과 얻으시길 바라겠습니다.
알석사꾸러기  |  2018.08.20   
답변 주셔서 감사합니다^^ 말씀해주신 부분들 참고하겠습니다. 

감사합니다~!
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