실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-
레벨5
유전학도^^v
-
18.08.09 17:01
1. Sample 내 target 농도가 낮을 때 primer 농도를 높여야 하나요? 낮춰야 하나요?
>> primer가 specific하게 작동을 하는 경우라면, 높일 경우 PCR이 더 잘 될 수 있습니다. 하지만 primer 자체가 제대로 작동하지 않는 경우에는 primer를 새로 design하는 게 맞다고 봅니다.
2. 1번에서 만약 primer 농도를 높여야 한다면 primer 농도로 인해 dimer 가 생길 확률이 커지지 않나요?
>> 맞습니다. 대신 PCR이 더 잘 될 수도 있습니다. 이건 직접 해 봐야 정확히 알 수 있습니다. primer가 specific하게 작동하면 dimer가 잘 생기지 않습니다. 그리고 primer 간 complement test를 해서 두 개 간에 double strand를 형성한다거나 또는 각 primer의 sequence 내에서 2차 구조가 형성되는지 확인해 봐야 합니다. 이렇게 하면 dimer 형성을 최대한 줄일 수 있습니다.
제가 예전에 사용했던 웹툴입니다.
http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html
3. Sample 내 target 농도가 낮을 때 Rna 농도를 높이기 위해 rna를 더 넣는 것이 옳은 것인가요? 아니면 1번을 고러하여 primer 를 높이거나/낮추거나 하는 것이 더 옳은 선택인가요?
>> 목적에 따라 다릅니다. target의 존재 여부를 확인하는 것이라면 template의 양을 늘리는 게 한 가지 방법이 될 수 있습니다. 하지만, 샘플 간 또는 다른 대조군과의 비교를 위한 것이라면 크게 의미가 없습니다. RNA를 더 넣고 cDNA를 합성하더라도 kit나 개별 재료 내에서 합성할 수 있는 capacity에 한계가 있습니다. manual에서 제공하는 적정 수준의 양을 사용하여 cDNA를 합성하는 게 좋습니다. primer의 농도를 높이는 건 해 볼만 합니다만, 일반적인 PCR 조건에서 증폭이 안 되는 것이라면 실험에 사용하기 어렵습니다.
참고하세요.
-
레벨1
대학원생111
(대학원생)
-
18.08.09 20:44
정말 좋은 답변 감사드립니다.
위에서 RT 는 real time 입니다.