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질문 Rt pcr 관련 문의
알대학원생111(대학원생)  |  2018.08.09 14:32
1. Sample 내 target 농도가 낮을 때 primer 농도를 높여야 하나요? 낮춰야 하나요?

2. 1번에서 만약 primer 농도를 높여야 한다면 primer 농도로 인해 dimer 가 생길 확률이 커지지 않나요?

3. Sample 내 target 농도가 낮을 때 Rna 농도를 높이기 위해 rna를 더 넣는 것이 옳은 것인가요? 아니면 1번을 고러하여 primer 를 높이거나/낮추거나 하는 것이 더 옳은 선택인가요?
#RT PCR
 
#Mrna
 
#Rna
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채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. Sample 내 target 농도가 낮을 때 primer 농도를 높여야 하나요? 낮춰야 하나요?

>> primer가 specific하게 작동을 하는 경우라면, 높일 경우 PCR이 더 잘 될 수 있습니다. 하지만 primer 자체가 제대로 작동하지 않는 경우에는 primer를 새로 design하는 게 맞다고 봅니다.


2. 1번에서 만약 primer 농도를 높여야 한다면 primer 농도로 인해 dimer 가 생길 확률이 커지지 않나요?

>> 맞습니다. 대신 PCR이 더 잘 될 수도 있습니다. 이건 직접 해 봐야 정확히 알 수 있습니다. primer가 specific하게 작동하면 dimer가 잘 생기지 않습니다. 그리고 primer 간 complement test를 해서 두 개 간에 double strand를 형성한다거나 또는 각 primer의 sequence 내에서 2차 구조가 형성되는지 확인해 봐야 합니다. 이렇게 하면 dimer 형성을 최대한 줄일 수 있습니다.

제가 예전에 사용했던 웹툴입니다.
http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html

3. Sample 내 target 농도가 낮을 때 Rna 농도를 높이기 위해 rna를 더 넣는 것이 옳은 것인가요? 아니면 1번을 고러하여 primer 를 높이거나/낮추거나 하는 것이 더 옳은 선택인가요?

>> 목적에 따라 다릅니다. target의 존재 여부를 확인하는 것이라면 template의 양을 늘리는 게 한 가지 방법이 될 수 있습니다. 하지만, 샘플 간 또는 다른 대조군과의 비교를 위한 것이라면 크게 의미가 없습니다. RNA를 더 넣고 cDNA를 합성하더라도 kit나 개별 재료 내에서 합성할 수 있는 capacity에 한계가 있습니다. manual에서 제공하는 적정 수준의 양을 사용하여 cDNA를 합성하는 게 좋습니다. primer의 농도를 높이는 건 해 볼만 합니다만, 일반적인 PCR 조건에서 증폭이 안 되는 것이라면 실험에 사용하기 어렵습니다.

참고하세요.

개구리유전학도^^v  |  2018.08.09   
Rt PCR 이란게... Real인지 아니면 reverse인지?,..,,

그리고 PCR 원리상 final cycle이 얼마를 설정하느냐에 따라 결과물이 달라지니깐...



primer 다이머가 생길확률은 RNA 넣지 말구 primer만 넣고 돌려보면 어느정도 확인 가능할꺼 같습니다.



.... 저 RT가 궁금하군요^^
알좌니  |  2018.08.09   
정말 좋은 답변 감사드립니다.
위에서 RT 는 real time 입니다.

알대학원생111  |  2018.08.09   
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