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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 overlap PCR 질문입니다.
올챙이rhksdn(대학원생)  |  2018.08.08 11:35
안녕하세요 .

overlap pcr을 처음 진행해보는 학생입니다.

3kb 두 fragment를 연결하려 하는데 처음에 overlap부분이 없어서 먼저 양끝에 20bp정도씩 extension시켜주었습니다.

extension pcr후 전기영동 band는 매우 뚜렷히 원하는 size위치에 1개 band만 나와서 잘 증폭이 된것 같습니다.

그 후 두 template를 넣고 overlap pcr을 해보려 하는데 결과가 안나오는것 같습니다.

1. 연장한 두 fragment를 1ul씩 넣고 KAPA mix를 사용한 후  똑같이 pcr 돌렷습니다.

2.  primer 뺴고 먼저 두 fragment 1ul씩 넣고 Kapa mix 10ul 넣고 95도 5분, 72도 10 분으로 polymerase후 거기다 primer 추가해 준후 20ul로 pcr넣엇습니다.

위 두가지 방법 다 했는데 전기영동시 아무것도 안나오네요.
두 fragment는 extension pcr증폭 후 gel elution하여 사용하였습니다.

세부 실험 조건이 잘못된건지 좀 알려주세요 ㅜ
#overlap pcr
 
#pcr
 
#overlapping
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.

primer 없이 PCR을 몇 cycle 하셨나요??
써주신 PCR 조건을 보니 annealing 조건이 없는데, 안쓰신건지 없이 하신건지 모르겠지만, annealing도 해야합니다~
primer 넣은 후에 잘 mix 해서 PCR 진행하셨나요?
gel extraction 하신 후에 농도 측정해서 농도는 맞춰서 하신건지 궁금합니다.

-  |  2018.08.14    
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