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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR fragment enzyme cut 하는데 잘렸는지 확인이 어렵네요 ㅠ
알클로닝ㅗ(대학원생)  | 2018.08.06 19:22
먼저 primer로 PCR 돌리면 나오는 fragment가 141 bp이고,

NdeI, pflMI 으로 enzyme 2 cut 하면 잘려나가는 조각이 14 bp와 26 bp 입니다.


조각이 너무 작아서 그런지 enzyme cut이 잘 됐는지 확인이 어려워요 ㅠㅠ


agarose는 1% 사용하고 있구요.


vector 같은 경우는 enzyme cut 후에 큰 조각, 작은 조각이 확인이 되는데
PCR fragment는 잘린게 안보여서 ligation 진행했는데 콜로니가 안뜨네요 ㅠㅠ


(insert가 작아서 ligation 됐는지도 전기영동상으로 확인이 힘듭니다...)


vector는 4Kb 인데 insert가 100 bp 여서 전기영동상으로 확인이 어려운거 같아요...


어떻게 하면 잘 볼 수 있을까요..? one cut 씩 진행해볼까요??
#enzyme cut
 
#NdeI
 
#PflMI
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리Applied_Microbe  |  2018.08.06   
Agarose gel의 %농도를 높이셔야 관찰 가능하실거 같네요
141bp를 효소로 절단해서 14bp와 26bp를 구분하시려면 agarose gel 은 최소 2%이상은 써야 구분 되실거같네요
개구리이스  |  2018.08.07   

fragment를 꼭 확인하셔야 겠다면 Agarose gel을 1% 와 4%2개 준비하세요.

그리고 2개 젤 각각 로딩하시고, 4%에서 fragment (14bp, 26bp), 1%에서 vector (4kb) 를 확인하시면 됩니다.


012  |  2018.08.07    
15 % polyacrylamide gel을 걸어보는 것을 추천합니다.

대왕개구리안재진  |  2018.08.10   
지금 vector 에 들어 가있 gene은 가지고 계신것으로 보이네요...
그렇다면 앞뒤 프로모터(터미네이터) 지역으로 PCR을 하세요. 그렇다면 클로닝하기 괜찮은 사이즈로 나올것이로 이걸 이용해서 자르면 될것입니다.

혹은 신규 enzyme site를 넣는거라면 PCR후 TA cloning 후 enzyme cut이 가장 기본적인 방법입니다.
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