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1. 발현량을 확인하는 실험을 진행하고 있는데, cDNA 합성시 RNA 농도를 꼭 맞춰야 하는지요? 후에
하우스 키핑진을 넣어 분석 프로그램이 normalization을 해주는데 꼭 맞출 필요없지 않나요?
; cDNA 합성 시 mRNA 농도를 맞추는건 기본입니다.
2. 꼭 맞춰야 한다면 cDNA 합성시 만약 한 샘플의 RNA는 2000 ng/ul일고 다른 한 샘플은 500 ng/ul 측정될때 첫번 째 샘플은 1ul 넣고 다른 샘플은 4ul를 넣는 식으로 맞추시는지요? 여쭤보니 희석하는 것보다 이렇게 stock 자체 볼륨을 건드는게 낫다고 하시더라구요.
; 저같은 경우는 A와 B라는 샘플이 있다면 두 시료를 먼저 농도를 측정 후 각각 일정 농도로 희석합니다. 예를 들어, 200 ng 정도로... 그 이 후에 다시 한 번 더 샘플들의 mRNA 농도를 잰 후에 농도가 일정하게 나오면 cDNA kit에 맞게 같은 volume을 넣습니다.
하지만, 그냥 희석배수로 지정해서 넣어주시는 분들도 많습니다.
3. 1번 질문과 같은 맥락인데 맞추지 않는다면 발현량에도 크게 차이를 보일 수 있나요?
; 애초에 농도가 다른 샘플을 GAPDH나 actin을 이용하여 맞추면 상관없지 않나 싶긴하지만 실험의 오차라는게 얼마나 나타날지 모른다는게 이쪽 실험이죠...
애컨데, GAPDH는 11 cycle 혹은 8 cycle에 디텍이 되었는데 메인으로 보는 유전자는 30 cycle 이상의 range에서 디텍이 된다면..... 아마 기존 보는 범위보다 크게 확대되어 차이를 보일겁니다. 실험의 목적상 method를 정하는건 실험자의 자유이지만... 그래도 왠만한 조건은 일정하게 맞추는게 좋치 않을까 싶습니다.
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바보멍청이
(비회원)
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18.08.02 15:19
답변 감사드립니다.
4000ng 샘플이 있었고 500ng의 샘플이 있었는데 각 1ul씩 넣고 cDNA 합성 후 발현량 분석한 결과와
500ng의 샘플을 8ng 넣고 cDNA 합성 후 발현량 분석 결과가 거의 비슷하게 나와 농도 맞추는 것이 크게 영향을 주는지 의문이였어서 질문 드려봤는데요, 혹시 상기 말씀드린 결과가 나온 이유에 대해 생각하는 바 있으신가요??ㅠ 다들 잘 모르셔서 물어 볼 곳이 마땅치 않네요.
일단 말씀하신것 처럼 기본적인 것이기에 농도 맞춰서 한번더 실험 해봐야 겠습니다!
감사합니다~