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레벨3
goviral
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18.07.25 23:32
random hexamer로 RT후에 PCR은 gene-specific primer로 하신 건가요?
만약 random hexamer만으로 RT-PCR 전 과정을 진행하신 거라면 결과가 쉽게 설명됩니다.
PCR은 specific primer set 가 커버하는 부위를 증폭시키는 것이니까요. PCR의 원리를 다시 한 번 생각해보시면 될 것 같습니다. random hexamer로 RT를 할 때 효율이 더 높다고 하는 이유는 아마 gene-specific primer와는 달리 존재하는 모든 RNA를 template으로 해서 cDNA합성이 일어날 수 있기 때문인 것 같습니다. 실험의 목적의 따라 또는 gene-specific primer의 효율이 높지 않은 경우에 random hexamer로 RT 진행 후, PCR은 gene-specif primer를 넣고 진행하면 됩니다.
아 찬찬히 답변해주신 글 읽으면서 생각해보니까 제가 어디서 잘못생각하고있었는지 알 것 같아요!
일단 다시 한번 실험을 진행해보겠습니다 정말 감사합니다ㅠㅠ
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180801
(비회원)
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18.08.01 17:39
RT-
PCR 은
cDNA합성과 PCR반응이
한 tube에서
동시에 진행되는 One-step
RT-PCR 법과
cDNA합성과
PCR반응을
분리해서 진행하는 Two-step RT-PCR 법으로
나뉩니다.
Two-step RT-PCR 법으로 진행하실 경우에 cDNA 합성시 1개의 Synthesis primer 넣고 반응 합니다.
* Synthesis
primer : random primer, oligo-d(T), gene specific primer
random
primer
: 일반적인 유전자 발현 해석에 사용
oligo-d(T)
: RNA의 3’poly(A)tail 부분부터 역전사반응 시작할 때 주로 사용
gene
specific primer
: 특정 유전자만을 검출하는 경우에 사용
cDNA 를 Template로 일반 PCR을 진행하면 Target band 를 확인하실 수 있습니다.
One-step RT-PCR 법으로 진행하실 경우에 gene specific primer 쌍을 넣어서 진행하게 됩니다.