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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 nuclear extract
올챙이가나다라abcd(대학원생)  |  2018.07.18 11:21
첨부파일 파일첨부: SFSFSDFSFS.PNG (432 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 현재 RAW264.7을 가지고 NF-kB를 보고있는 학생입니다.

다름이 아니라 제가 몇달동안 이 실험을 진행해도 진척이 없어서 질문을 올리게되었습니다.

Buffer A: 10mM HEPES, 10mM KCL, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 4ug/ml Aprotinin, 2ug/ml Pepstain

Buffer C: 10mM HEPES, 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 0.1% IGEPAL, 1mM DTT, 1mM PMSF, 4ug/ml Aprotinin, 2ug/ml Pepstain

Buffer A를 이용하여 pellet을 washing후에 centrifuge를 돌린다음 상등액 제거한뒤 buffer c 주입를 주입하여 염농도 차이로 핵을 깨는데 Western blot을 해보면 핵내만 존재한다는 단백질인 Lamin B는 거의 발현되지않고 NF-kB만 잘나옵니다.(사진첨부, 사진은 흰색밴드 밑에가 Lamin B로 추정하고 있습니다. NF-kB의 사진은 따로 첨부하지 않았습니다.) 저는 이게 핵이 분리가 덜되어서 NF-kB의 경우는 Cytosol과 섞여있어서 잘나오지만 Lamin B는 핵분리가 덜되서 잘 안나온다고 생각합니다. Buffer나 method중 어느부분이 잘못되었는지 알려주시면 감사하겠습니다.
또 여러 고수님들의 실험방법을 알려주시면 감사하겠습니다.

#nuclear
 
#extract
 
#nf-kb
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리kakaoblack99  |  2018.07.26   
NF-kB는 cytoplasm에 존재하고 있다가 stimulation에 의해 Nucleus로 들어가는 걸로 알고 있는데 혹시 핵막이 제대로 안 부셔진게 아닐까요?
올챙이가나다라abcd  |  2018.07.27   

저도 그렇게 생각해서 buffer 조성을 다르게 하려고 생각하는데 혹시 buffer조성이나 프로토콜좀 알려주실수 있으신가요?ㅠㅠ

개구리kakaoblack99  |  2018.12.20   

추가 답변이 달린지 모르고 있다가 지금봤네요..


너무 늦게 대답해드리는거 같긴 하지만,


저 같은 경우 cytoplasm과 nuclear를 fraction하는 방법이 buffer만으로도 할 수 있고 필요에

따라 homogenizer를 이용하기도 하는데


쉬운 방법인 buffer만으로 이용하는 방법은


25mM KCl, 5mM MgCl, 10mM tirs-HCL (ph.8.0), 0.5% NP40, 1mM DTT, 1x protease and

phosphates inhibitors


이 버퍼로 15min간 ice에서 incubation하여 cell membrane만 lysis하고 centrifuge,

13,000RPM으로 분리하면 깔끔하게 잘 분리되었습니다. (washing해주면 더 좋구요.)

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