실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Extraction/Isolation
nuclear extract
레벨3 가나다라abcd (대학원생)
안녕하세요 현재 RAW264.7을 가지고 NF-kB를 보고있는 학생입니다.
다름이 아니라 제가 몇달동안 이 실험을 진행해도 진척이 없어서 질문을 올리게되었습니다.
Buffer A: 10mM HEPES, 10mM KCL, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 4ug/ml Aprotinin, 2ug/ml Pepstain
Buffer C: 10mM HEPES, 50mM NaCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 0.1% IGEPAL, 1mM DTT, 1mM PMSF, 4ug/ml Aprotinin, 2ug/ml Pepstain
Buffer A를 이용하여 pellet을 washing후에 centrifuge를 돌린다음 상등액 제거한뒤 buffer c 주입를 주입하여 염농도 차이로 핵을 깨는데 Western blot을 해보면 핵내만 존재한다는 단백질인 Lamin B는 거의 발현되지않고 NF-kB만 잘나옵니다.(사진첨부, 사진은 흰색밴드 밑에가 Lamin B로 추정하고 있습니다. NF-kB의 사진은 따로 첨부하지 않았습니다.) 저는 이게 핵이 분리가 덜되어서 NF-kB의 경우는 Cytosol과 섞여있어서 잘나오지만 Lamin B는 핵분리가 덜되서 잘 안나온다고 생각합니다. Buffer나 method중 어느부분이 잘못되었는지 알려주시면 감사하겠습니다.
또 여러 고수님들의 실험방법을 알려주시면 감사하겠습니다.
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