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질문 Real-time PCR 용 프라이머 조건을 잡고 있습니다.
올챙이꿈꿈이(대학원생)  | 2018.06.23 09:14
첨부파일 파일첨부: 11.png (174 KB)
이미지 첨부파일
gDNA에서 먼저 test하고 있는데요,

왼쪽 두레인이 타겟 유전자고, 오른쪽 두 레인이 GAPDH 입니다.

화살표가 타겟 밴드들이고요,

리얼타임용으로 쓸만한 조건인가요?

우선 AT = 60도로 진행했고요,

다이머가 있어도 리얼타임에 쓸 수 있는지 궁금합니다.

GAPDH는 AT를 조금 올려서 원밴드를 만들 예정입니다.

타겟 유전자는 어떻게 변화를 줘야 할까요 ?

조언 부탁드립니다.


그리고 조건 AT가 서로 다르게  잡히면,

cDNA 추출후 동량 걸고, 그 조건으로 Real-time을 따로 돌려야 하나요?


#RT-PCR
 
#Primer
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
BU  |  2018.06.24    
리얼타임 피씨알로 하는 이유는,

1. 수치로 정량화 할 수 있다.
2. 패플이 제안한 "델타 델타 방법"으로 쉽게 정량적 비교를 할 수 있다 (진 익스프레션)
3. 스탠다드 커브를 그리는 방법으로 보다 정확히 정량 비교를 할 수도 있다 (진 익스프레션)

지금 님이 하고 있는 것은 

1. genomic DNA. 를 바로 템플릿 디엔에이로 사용
2. primer designed to detected "genomic DNA" sequence (not transcript/mRNA sequence)로 어떤 디엔에이 시퀀스가 "존재하는지 존재하지 않는지"를 찾고 있어요.
3. 님이 보여준 아가로스 젤이 재현되는 결과라면, 화살표 방향 외에 non specific band들이 아주 많이 있어요. 그 벤드가 오로지 한 개 만 뜨도록 해야만 리얼 타임 피씨알의 의미가 있습니다. 그렇지 않으면, 리얼타임 피씨알로부터 "false positive)가 포함된 과장된 결과를 얻게 될 확률이 매우 높아요.

해결방법
1. nested PCR 용 프라이머를 설계하여 오로지 밴드가 하나만 뜨도록 해본다 (젤로)
2. 비로소 아가로즈 젤에서 한 개의 스피시픽 밴드를 찾게 될 때, 그 프라미러와 지노믹 디엔에이로 리얼 타임 피시알을 할 수 있겠습니다.

질문: 그런데 왜 지노믹 디엔에이로 피씨알을 했나요? 지노타이핑 하는 건가요? 갭 디에이치를 함께 사용한 이유가 납득하기 어려워요. 지금 비교하는게 엠 알앤에이가 아닌데 왜 갭디에치를 하는지?
올챙이꿈꿈이  |  2018.06.24   
타겟 유전자 발현여부를 확인 하려하는데요 발현여부가 불확실 하여 gdna로 우선 프라이머 pcr 조건을 잡으려고 수행 한것입니다 조건이 잡히연 cdna 에서 다시 수행할 예정입니다 anealing temp을 올려서 원밴드를 만들려 하는데요 그렇게 잡힌 프라이머 AT 조건을 후에 cdna로 진행시 리얼 타임에 적용해도 되나요? 그리고 cdna 증폭을 위해 프라이머를 짤 때 gdna 시퀀스중 orf 시퀀스를 ref두고 짰는데요 이게 문제가 되나요?
BU  |  2018.06.25    
cDNA를 검출하는 프라이머는 gDNA를 검출하는 프라이머와 다르겠죠. 지금하신 젤 실험은 mRNA (cDNA) expression 을 qRTPCR 하는 것과 관련없어요.

어떤 gene의 MRNA expression을 알려고 하나요? Gene name?
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