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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 gene의 크기에 대해서 궁금해서 질문드립니다.
알깐건(대학생)  |  2018.05.22 11:50
pcr을 배우다가 melt curve가 이상해서 자문을 구해보니 agarose gel로 내려보라고 하네요

이 agarose gel로 하는게 western blot을 하는것 처럼 마커를 걸고 하던데 그러면 제가 보려는

gene의 size를 알아야하는 건가요??

그렇다면 이 gene의 size는 어떻게 알아야하나요?

저는 지금 쥐의 간에서 갈아서 뽑은 rna에다가 iNOS primer를 붙여서 보고있는데

참고한 논문에서는 iNOS의 primer product size가 105bp라고만 나와있어서요 

이 105bp가 gel에 마커를 같이 걸고 했을 때 보고자 하는 위치인건가요??

너무 기본적인 질문이라서 황당하시겠지만 도움좀 구해보겠습니다.
#rna
 
#gene size
 
#agarose gel
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이BU  |  2018.05.22   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
대략 님이 생각하는게 맞을 확률이 있는데 몇가지 전제/확인할 사항이 있어요.

1. gene of interest: iNOS

mouse iNOS mRNA expression 을 알아보는 것이 목적인데, 프라이머가 불분명해요. 프라이머의 포워드 & 백워드 시퀀스를 알고 있나요? 그것을 알면, mouse iNOS transcript의 어느 부위 (엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, ....?)를 센싱/검출하도록 설계되었는지 알 수 있고, 그 정보를 안다면, 내 프라이머가 센싱하는 시퀀스/베이스페어의 개수를 세워보면 베이스페어의 사이즈 (예. 105 bp)가 결정되요.


2. primer designed or bought from the vendor

논문을 참고한다고 하는데, 그 논문에 쓴 프라이머가 님이 사용하신 프라이머와 같다는 것이 증명되어야 해요. 구매해 쓰는 것이라면, 그 논문에 혹시 업체명, 카탈로그넘버가 나와 있다면 서로 비교하면 될 것이고, 그 논문에 시퀀스가 나와 있다면, 그 시퀀스를 가지고 님의 지금 가지고 있는 프라이머와 같은지 비교해 보면 되겠네요.

위 두가지가 다 확실하다 (1. 마우스 아이노스 진 검출이 목적 2. 프라이머가 시퀀스 / 논문프라이머일치)면, 님 예상대로 아가로즈 젤로 전기영동한 후 젤에 뜨는 105 bp 위치가 님의 마우스 아이노스 엠알엔에이 익스프레션이 되는 목표 위치입니다.
올챙이타박  |  2018.05.22   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
qPCR인가요? melt curve가 이상하다는 얘기는 예상하지 않은 PCR product 가 있을지도 모른다는 얘기니까 agarose gel electrophoresis를 해 보면 확인할 수 있죠. 참고하신 논문에 나온 것과 같은 프라이머, 같은 template를 사용했다면 PCR product 의 크기도 같을 것이고, 그 논문에서 105 bp 라고 나왔다면 깐건님의 PCR에서도 같은 크기의 product가 나왔는지 확인해 보면 되겠죠. 그게 아니라면 ncbi 등에서 실험에 사용한 동물의 genome 이나 target gene의 시퀀스를 확인하시고, 사용한 프라이머가 어디 붙는지 확인하시고, 그래서 product의 크기가 얼마나 될지 계산해 보시면 됩니다. 그래서 agarose gel을 내려 보시고, product 의 크기가 예상한 것과 같은지, band는 하나만 깨끗하게 뜨는지 그런 것들을 확인해 보시면 됩니다.
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