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질문 Restriction enzyme 처리에 관해 질문드려요ㅠㅠㅠ
알dyddnr2000(과기인)  |  2018.05.04 17:10
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20180503_191404109.png (239 KB)
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안녕하세요 restriction enzyme 처리를 하고 있는 학생인데요.
target gene을 sequencing하여 enzyme bing site를 확인했는데 restriction eznyme 처리 후 컷이 되지 않아요ㅠㅠ 위 사진은 랜덤샘플 5개에서 pcr 후 enzyme 처리과정을 37도에서 1시간 20분, 80도에서 20분간 inactive 시킨것입니다. 또한 엔자임은 전부 새로 주문한 것이라 상태가 매우 좋아요. 사진 이외에도 엔자임 컷 시간은 1시간,1시간30분도 해보고 다른 샘플을 여러번 이용해 보았지만 약간의 컷도 되지 않았습니다. 도대체 무엇이 문제일까요??ㅠㅠ
#restriction enzyme
 
#pcr
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지나가다  |  2018.05.04    

질문이 잘 이해가 안됩니다.
시퀀스 그림에 나와있는 것 처럼 DpnI binding site를 확인하셨다는 것인가요?
그런데, DpnI 은 GATC 를 인식하고 절단합니다. SNP 때문에 GGTC가 GATC 로 바뀌어서 DpnI으로 절단되어야 하는 것인지요?
https://www.neb.com/products/r0176-dpni#Product%20Information

개구리Zipnote  |  2018.05.05   
DpnI cut 하려면 sequencing 결과가 GATC로 나와야죠.

PCR을 통해 저 부분에 mutation을 만들었다는 건가요??
알dyddnr2000  |  2018.05.05   
지나가다님 말씀처럼 SNP때문에 GATC가 되어 절단되는것이 맞습니다.

그렇기때문에 여러 샘플을 가지고 절단을 시도 해보았는데 절단이 되는것이 하나도 없어서

엔자임 처리상에 문제가 있는것인지 아니면 다른 이유가 있는것인지 모르겟네요ㅜㅜ


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