binding assay가 아니라 스테인해서 co-localize 보여주는 것?
예. ligand: PDGF
receptor: PDGFR
goal: To show colocalization of anti-PDGF immunofluorescence and anti-PDGFR IF.
design: PDGF : green (Alexa488)
PDGFR: red (Texas red)
1. fix with 4% PFA in PBS or methanol briefly
2. wash and blocking (e.g. with 10% goat serum)
3. wash and primary antibody in blocking sol. overnight (rabbit anti-PDGF)
4. wash and secondary antibody in blocking sol. 1 h at RT (goat anti-rabbit Alexa488)
5. wash and primary antibody in blocking sol. overnight (mouse anti-PDGFR)
6. wash and secondary antibody in blocking sol. 1 h at RT (goat anti-mouse Texas red)
7. wash and mount with mounting media containing DAPI (From Santa Cruz)
Expected result: if working, " yellow " or " co-localization of green and red " should be evident in which PDGF binds to PDGFR or where PDGF ab is colocalized with PDGFR ab.
Note. permeabilization : tritonx100 included in blocking sol.
"진행한다" 이런 말 이상함. 님이 유재석이에요 진행하게?
그냥 "한다"고 하는 게 맞음.
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레벨2
thdms0203
(대학생)
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18.05.03 09:06
감사합니다
저도 protocol은 저대로 비슷하게 하고있긴 한데,
궁금한 점은 이때 anti-PDGFR이 PDGFR에 결합하여 PDGD가 PDGFR에 binding하는 것을 막게되는 것 아닌가 궁금하여 질문 남겼습니다
"진행한다"는 말이 왜 이상한것인지 모르겠네요;;;;;;
MC들이 사회를 보는것도 진행한다고 말하지만, "진행하다"라는 것이
일을 처리한다는 뜻인데;;;;;
그리고 시험은 질문자님께서 쓰신것과 저도 똑같이 생각합니다.
1. Receptor와 binding하는 antibody에 의해, ligand binding이 공간적으로 방해받을수 있으니,
cytoplasmic part를 잡으면 좋을것 같습니다.
그리고, 그럴경우엔 permeabilization반드시 하셔야 하고요~ (Triton X-100)
2. cloning해서 transfection하셔도 되지만, cloning 작업 / transfection 등
좀 복잡해지지 않을까요?
혹은 Co-localization을 보는것은 어떠신가요?
ligand 따로 / Receptor 따로 IHC해서 image merge 시키는 방법으로요.
Co-localization은 직접 binding은 아닌 간접적 증명이기는 하지만, 그렇게도 많이 보는것 같습니다.
"....anti-PDGFR이 PDGFR에 결합하여 PDGD가 PDGFR에 binding하는 것을 막게되는 것 아닌가 궁금하여 ..."
살아있는 세포나 동물에 투여했을 때는 그렇게 막게 되는 일이 일어날 수도 있겠죠,
하지만 이미 님은 고정액으로 (독성 강함) 세포나 조직을 완전히 죽여 놓고 스테인 하는 것 아닌지?
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레벨2
thdms0203
(대학생)
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18.05.06 18:23
곰돌 2님 답변 감사드립니다~ ^^
제가 cell을 가지고 IF를 하게 되는데, 만약 Co-localization을 해서 각각의 사진을 찍어 merge를 한다면 같은 부분이아니라 다른 부분을 찍게 되는데 어떻게 merge가 가능한 것인가요?
예를 들어 하나의 cover slide는 red-labeled protein을, 다른 cover slide는 488-labeled receptor antibody를 사용한다 했을 때 두 cover slide의 cell은 같은 부분이 아니라서 merge를 하게되면
겹쳐지지가 않거든요 ㅠㅠ 다른 방법이 있으신가요?
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레벨2
thdms0203
(대학생)
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18.05.06 18:25
BU님 답변 감사드립니다.
네 저는 4% paraformaldehyde로 fixation을 한 뒤 blocking을 하고 antibody & protein을 처리하게 되는데,
죽은 세포이긴 하지만 이미 anti-PDGFR이 PDGFR에 binding해버리면 PDGF가 PDGFR에 biniding하는 것이 어려워지지 않나요?