질문 : 1차붙이기전 PROTOCOL 을 구하고싶습니다. 정말 전문적으로 하시는분들 프로토콜 부탁드립니다. 공개안하겠습니다.
ymxki@naver.com 으로 보내주시면 감사하겠습니다.ㅠㅠ 꾸벅
이메일 보내기 번거로와 여기 씀:
(1) 전통적 크라이오 섹션으로 하는 방법
- 잘 섹션한 것을 글래스 슬라이드에 마운트해서 -20 냉장 저장.
- 준비되었으면 스테이닝 시작하기 위해 룸 템퍼리쳐에 가져다 놓는다.
- 10분 15분 후 녹았으면, 펩 펜으로 섹션 조직 주위를 덮어서 물 안새게 한다.
- PBS wash (5 min)
- blocking (10% goat serum, tween 20 1-2 drop, tritonx100 0.01%) 1 h at RT
- primary antibody (1:500 or etc) in blocking solution overnight (O/N) at 4 C
(2) floating method
- section and collect tissue in 24-well dish with PBS+sodium Azyide
- wash with PBS
- blocking (10% goat serum, tween 20 1-2 drop, tritonx100 0.01%) 1 h at RT
- primary antibody (1:500 or etc) in blocking solution overnight (O/N) at 4 C
질문 2 : 저희가 손상된조직에도 if 를 염색하는데 그 손상된 조직에도 형광이 너무 심하게 먹어
같은 섹션 비손상 조직이 대조적으로 시그널이 약하게 찍힙니다. 그 손상부위 부분을 좀 약하게 하는 방법이 없을련지요..
- intracardial perfusion with 4% PFA
- intracardial perfusion with PBS
위 두 과정을 했어요? 뭐 어떻게 손상된 조직이며 어느 부위인지? 브레인?
질문3 : 프로토콜중에 셀이 아닌데 전 조직에서 하거든요.. FBS로 블럭킹하는데 이렇게 해도될까요?
- host of secondary antibody?
e.g. if your secondary antibody is, anti-mouse Alexa288 raised in goat (host = goat), then,
blocking solution should include "goat serum" (usually 10 %)
e.g. if your secondary antibody is, anti-mouse Alexa594 raised in donkey (host = donkey), then, blocking solution should include "donkey serum" (usually 10 %)
FBS = fetal bovine serum
Is your secondary antibody raised in bovine (cow)? I have never seen "blocking with FBS".
Who is your advisor? In which discipline of science are you working? Neuro- cardio- bone?