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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 qRT-pcr protocol 문의.
개구리순똘(대학원생)  | 2018.04.27 11:00
안녕하세요. PCR, RT-PCR만 해보고, qPCR이나 qRT-PCR은 해본적 없는 학생입니다.

qRT-PCR를 해보려고 셋업을 하고자 하는데,
몇가지 의문이 있어서 문의 드립니다.

1) 보통 qPCR할 때엔, 관심 유전자의 길이가 길더라도,
100-200 bp정도 부위만을 증폭시킨다고 하는 것 같은데,
그 이유는 뭘까요?
그냥 elongation하는 시간을 짧게하여, 실험시간 단축이 유일한 목적인가요?

2) 보통 PCR은 94도, 50-60도, 72도 denaturation/annealing/elongation 3 step인데,
qRT는 94도, 50-60도 denaturation/annealing (+ elongation) 2 step인것 같습니다.
증폭하는 유전자의 길이가 짧아서 elongation step을 따로 안하는건가요?
아니면 qRT 용의 polymerase가 따로 있고, 그 enzyme의 특징인가요?

3) SYBR green으로 측정하고자 하는데, 혹시 저렴한 제품 아신다면 추천부탁드립니다.
#qPCR
 
#qRT-PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
BU  |  2018.04.28    
sybr green PCR 하면 1), 2)번에 관해 아무리 들여다 보아도 알 수 없어요.


elongation, denaturation, annealing temp가 적절한지를 점검하는 gradient PCR이 별도로 있고, 그런 PCR은 큐피씨알 하기 전에 전통적인 "젤 베이스드 방법"으로 다 해놓는 것입니다.

싸이버 그린 피씨알을 하실 때" 온도"를 걱정하실 일은 딱 한 군데 밖에 없는 경우가 거의 대부분입니다. 그것은, 님의 프라이머를 설계할 때 결정되는 것이고, 프라이머가 타켓 시퀀스를 센싱하는데 적정한 온도를 설계 단계에서 예측해 주는 프로그램에 있습니다.

지노타이핑을 큐피씨로 하는 경우도 예외적으로 일부 있지만, 대부분의 큐피씨알은 RNA expression assay일 것입니다. 그러므로, 님의 사용하실  (구매로) 혹은 설계한 프라이머가 님의 qRT PCR annealing temperature를 결정할 것입니다.

많은 경우 프라이멀 쓰리 온라인등으로 설계해서 쓰신 프라이머라면, 싸이버그린 큐피씨알 하실 때, "60도" 혹은 55 - 60 도 사이에서 설정하여 해보시면 쉽게 알 수 있어요.

프라이머를 구매해서 쓰신 다면, 설계한 업체에서 "적정온도"를 제시해 주니 그걸 따라서 하시고, 님이 설계해서 쓰신다면, 온도를 어떻게 정하는지 " qiagen " website 가서 프로토콜 다운 받아 찾아보세요. 그렇게 어렵지 않게 알 수 있어요.

3) SYBR green으로 측정하고자 하는데, 혹시 저렴한 제품 아신다면 추천부탁드립니다
==> qPCR master mix가 저렴한 것을 묻는 것인지, 아니면 뭘 추천해 달라는 것인지? 프라이머 사게 살 수 있는 곳을 말하는 것인지?

결론) 호기심 많으신 것은 좋은데, 지금 님은 1), 2)번을 고민하실 단계가 아닌 것으로 판단됨.

아마도 한국에 위치한 랩 같습니다. 만일 맞다면, 도대체 한국에는 왜 지도교수들이 이런 기본적인 것 조차 알려주지 않아, 이렇게 황망하고도 어이없는 질의가 올라오는 것인지 안타까와 적었습니다. - 미국서.
hi  |  2019.07.15    

1번 질문의 경우, qPCR 의 목적이 관심 유전자를 다량으로 불려서 쓰는 게 아니라

quantification 에 있기 때문에 굳이 관심 유전자 전체를 다 증폭시켜야 할 까 생각이 듭니다. 관심 유전자를 특정할 수만 있으면, 100-200 bp 만 증폭시켜도 해당 유전자가 많은지 적은지 알 수 있으니까요..!

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