제일 중요한 것을 적지 않으셨네요 (에러의 원인: 소스).
"티슈" 입니까, "쎌" 입니까? (mouse, rat, pig, monkey, sheep or human?)
If tissue, where? (brain, liver, heart, kidney, pancreas, bone, cartilage, blood etc....?)
If cell, which type? ( blood cell, platelet, neuron, smooth muscle cell, endothelial cell etc....?)
total RNA isolation through 1) Beta-ME or 2) QiaZol or /TriZol?
시작할 때 lysis buffer가 무엇입니까? 1)인가요 2) 인가요?
GAPDH와 베타 엑틴의 CT value 는 많은 샘플을 동시에 준비해서 하면, 굉장히 일관됩니다.
n=1 (total RNA from one animal or from one cell from one animal)을 하루에 합니다. 그런 식으로 열개 이상 샘플을 모아서 열 하루가 되는 날 -80 냉동고에서 꺼내서 씨디앤에이 만들고 알티피씨알 해보세요.
모든 에러는 단계 1에서 시작됩니다. 단계 1은 "조직 혹은 세포로부터 RNA 분리" 단계. 여기서 일관되지 않으면 그 뒤에 아무리 보정하려해도 다 시간 낭비입니다. 낙동강 상류에서 계속 오염수와 똥덩어리를 버리고 있는데, 하류에서 물이 깨끗해 지기를 바라는 것이랑 똑 같아요.
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레벨1
yelin
(대학원생)
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18.04.27 10:58
먼저 답변해주셔서 너무 감사합니다!!
저는 human mesenchymal stem cell 을 이용하고 있습니다.
2) trizol을 이용합니다.
첫 단계에서 문제가 생겼을 확률이 큰걸까요??
제 프로토콜은
1) -80도에 보관되어있는 0d, 3d sample을 꺼내어 살짝 녹이고(약 5분)
2)
trizol 0.5ml을 처리합니다. (처음 cell number= 3*10^5입니다. 3일후 약간 감소해서 2.5*10^5정도 되는데 trizol 양을 바꿔 처리해야할까요?)3) 파이펫팅으로 ep tube로 모아, 약하게 vortexing, 5분 상온
4) chloroform 100ul, 3분 상온
5) 4도, 12,000rpm 15분 centrifuge
6)
물층만 새로운 ep tube로 분리7) 물층과 같
은 양의 isopropanol을 넣고 3~5번 정도
inverting, 10분 상온
8) 4도, 12,000rpm 10분 centrifuge
9)
용액 버리고, pellet을 75% EtOH 0.5ml wash10) 4도, 7500rcf 5분 centrifuge
11)
용액버리고 airdry하고 DEPC 10ul, 상온 10분입니다.
제가 의심하는 부분을 볼드로 했습니다! 260/230이 wash에 관련되어있다고 하는데, 저는 대부분 0.5값을 가진게 문제일수도 있을것 같습니다.
자세하게 적는다고 했는데,,, 처음 질문하는거라서 중요한 정보가 빠졌네요 ㅜ.ㅜ
그래도 답변해주셔서 정말 너무 감사합니다!!
https://biosci-batzerlab.biology.lsu.edu/Genomics/documentation/3130_NanoDrop_tips.pdf
링크보세요. 260/230은 보통 워싱 미흡에 의한 factor라고들 하는데 맞긴 맞습니다.
잘 뽑으면 280/260 수치보다 0.2 정도 또는 그 이상으로 높게 나옵니다.
저 같은 경우 RNA는 280/260 2.0~2.2에 260/230은 2.2~2.5 정도로 티슈에서 뽑아요.
RNA에서 cDNA로 RT-qPCR을 하시는 경우라면, Reverse transcription을 kit 프로토콜양 또는 권장량 이하로 하는지 체크도 필요하실 듯요. Kit가 권장하는 양 이상의 RNA로 Reverse transcription 하면 100% 변환되지 않습니다... 최종 cDNA 양에 영향을 주는거죠.