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1. 어떤 목적으로 lysate를 만드셧는지 (어떤 lysis buffer인지.) 모르겠습니다. DNA를 확인하고자 하는 실험이라면 DNase 가 없는 상태여야 할텐데, DNase가 포함된 lysis buffer를 이용하셧다면 왜 agarose에 내리신건지..
2. DNA ladder라 함은 agarose gel에서 size marker를 말씀하시는 건가요? 그걸 lysate랑 섞었으면 당연히 size marker의 band가 보일것 같은데요 ..
어떤 실험을 하고 계시는건지 정확히 말씀해 주시면 더욱 도움이 될것 같습니다.
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레벨5
kakaoblack99
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18.04.06 23:07
제가 봤을 때는 cell에 존재하는 DNase와 크기가 알려져 있는 DNA ladder를 반응시켜 DNA fragment를 만드는 실험을 하신거 같은데, 일단 DNA 전기영동에 어떠한 buffer를 쓰셨는지 궁금하네요.
보통 사용하는 TAE, TBE buffer를 사용하는데 이 buffer에는 EDTA가 존재하여 DNase 활성을 방지하는 역할을 합니다.
또한 lysis 할 때 어떤 buffer를 쓰셨는지 조성표를 확인해보시고, 자세히는 모르지만 DNA marker는 제품으로 제작되기 때문에 fragment가 되지 않게 메틸화나 아세틸화와 같은 특별한 modification이 되어있을 수도 있어요.
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레벨3
dbkorea
(과기인)
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18.04.09 16:27
kakaoblack99님,
제가하는 실험은 dnase 활성을 확인하는 실험입니다.
입사해서 어떻게 설명을 들었냐면, positive control로서 Hela cell lysate를 쓰는데, 여기는 dna가 있으므로 dnase가 ㅅ활성화되어 gel에 내려보면 밴드가 안뜨고,
negative control로서는 LRW를 쓰는데 여기는 dnase가 없어서 gel 내려보면 밴드가 뜬다고 들었습니다.
근데 hela cell lysate 내려보면 밴드가 뜨는 이유를 모르겠습니다.
ripa buffer는 tris, np-40, sodium deoxycholate, sds를 써보기도 하고 np-40대신 tritonX100을 써보기도 했습니다.
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레벨5
kakaoblack99
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18.04.10 16:26
1. DNA 전기영동 하실 때 사용하신 buffer는 어느 buffer를 쓰셨나요?
2. RIPA buffer를 쓰셨다고 하면 pellet과 supernatant를 나누는 fraction을 하신건가요?
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np-40, sodium deoxycholate 는 비이온성 계면활성제로 단백질로 이루어진 효소의 구조 변성에 치명적인 이온성 계면활성제인 SDS의 활성을 억제해준다고 알고 있는데 농도상으로 조건이 안 맞는거 아닐까요?