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가장 일반적인 cloning 방법은
primer 제작, 이때 양끝에 restriction site를 붙임.
균에서 plasmid 정제
plasmid랑 primer를 이용해서 PCR
PCR product 정제 & restriction enzyme 자름
Vector 역시 같은 restriction enzyme 자름
2개를 ligation 시킴. 그리고 E.coil DH5a로 transformation 시킴...
위에 방법은 몆 단계 과정을 거쳐야 하는데
요즘은 더 간편한 방법이 있습니다.
Gibson assembly 방법 입니다.
균의 plasmid에서 원하는 부분만 primer로 PCR 합니다.
Vector도 역시 원하는 부분만 PCR 합니다.
(이때 만들어진 2개의 fragment는 서로 overlap이 일어나서 circular 형태가 될수있게 primer 제작해야 합니다)
그 다음 2개의 fragment를 섞고 Gibson reagent를 넣고 1시간 반응시키고 바로
E.coil DH5a로 Transformation하면 끝...
맘만 먹으면 하루면 끝낼수 있어요
linear DNA든 circular DNA든 PCR template로 사용하는 것은 같습니다.
plasmid를 template로 PCR 할때도 gDNA를 template로 사용할때와 동일한 방법을 사용합니다.
정 걱정스러우면 plasmid의 클로닝할 유정자가 아닌 다른 부위를 제한효소로 잘라서 linear from으로 만든 후 PCR하면 됩니다.