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지나가는 동지1
(비회원)
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18.03.10 00:50
안녕하세요, 저도 똑같은 어려움을 가지고 실험에 임했었습니다.
먼저 박테리아의 strain이 무엇인지 명확히 해야합니다.
저같은 경우, Ecoli에서 하였는데요, CRISPR는 절단 기능만 있고 DNA를 붙이는 기능(repair)이 따로 없다고 알고있습니다. 때문에 따로 recombinase가 필요합니다.(동물세포의경우 자체 내 repair기능이 있습니다.) 저는 이것을 모르고 crispr만 넣었다가 cell이 거의 나오지 않거나 mutation이 되었습니다.
과기인 께서 실험하시고자 하는 strain에 DNA repair기능이있는지 먼저 확인해보시기 바랍니다.
1, addgene에서 cas9 gene들어있는 vector와 gRNA들어있는 vector가 따로 있는 것으로 사서 썼습니다. (박테리아로 실험한 것이 하나 있을것입니다.)
2. 만일 Ecoli라면 두 gene이 같이 있는 vector는 클로닝이 힘듬니다.. (아무래도 Ecoli내부 gene을 타켓팅하는 것으로 클로닝을 하니까요..)
제가 찾은 vector는 recombinase 또한 같이 발현하는 것이였습니다. 그 논문 보시면 자세히 프로토콜이 나와있습니다. CRISPR를 가진 cell을 recombinase 발현 시키면서 com cell로 만든 후 gRNA 백터를 넣습니다.
3.이 또한 그 논문에 있으며, (정확히는 기억이 안나서요;;) 20이면 충분했습니다.
4.박테리아도 NGG입니다.
그리고 웬만하면 gRNA 디자인은 인터넷에서 디자인 툴을 이용하는것이 좋습니다.
인터넷에 gRNA design이라고 치면 몇 사이트가 나옵니다.
이들 중에는 target off도 줄이기위한 계산까지 들어가있는것도 있을것입니다.
하지만 이것을 이용하라면 박테리아가 흔한 것이여야해요.. E.coli조차도 지원안하는 사이트가 많습니다. (제가 이용한 사이트는 없어져서..ㅠㅠㅠㅠ따로 찾아보셔야할것같아요.)
아니면 컴퓨터 프로그래밍 언어를 아신다면 , 리눅스에서만 확인할수있는 디자인 툴도 있습니다. 이것은 원하는 strain으로 찾을수있습니다. (chromosome total seq를 직접 넣어서 계산할수있으니까요)
제 실험정리 노트가 다른곳에 있어서, 정확한 이름이나 정보를 드리지 못한점 죄송합니다.
하지만 쉽게 찾으실수있을겁니다. 여러개가 아니라서 혼동도 안되구요
도움이 되셨으면 좋겠습니다.
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레벨2
YKim
(과기인)
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18.03.10 00:57
제가 작성한 질문이 너무나 중구난방이라 방금 새로 질문작성하고 이글 지우려고 들어왔더니 답변 달아두셨군요. 감사합니다~!!!!!!
타겟 호스트는 Xanthobacter autotrophicus라는 strain입니다. 그리고 gRNA 툴 찾아서 서치해 보겠습니다.
박테리아 knock-out이 비효율적이라는 말은 많이 들었는데, 그래서인지 자료가 많지 않네요.
다시한번 감사드립니다!