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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 박테리아의 gDNA 추출 및 플라스미드에 도입 질문
알lonnie2000(중고생)  |  2018.02.10 19:01

팀 과제연구를 기획하는 도중 어려움이 생겨 질문하게 되었습니다.
이미 genome 전체가 밝혀진 박테리아의 DNA에서 특정 유전자에 해당하는 부위를
잘라내어 이걸 다른 플라스미드에 붙이는 실험을 하고 싶은데, 이론 상으로는 이해가
됬지만 실제로 어떤 키트를 사용해야 할지 막막해서 질문을 드립니다. 실험 내용을
간단히 정리하자면 아래와 같습니다.

1. 박테리아 gDNA(플라스미드가 아닌)에서 특정 유전자를 포함한 부분 추출
2. 다른 플라스미드에 유전자를 이어 붙임
3. 재조합한 플라스미드를 대장균에 도입 
 
전문가분들의 도움(특히 키트나 소모품 추천)을 구합니다.  

#재조합
 
#플라스미드
 
#gDNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
Cell  |  2018.02.11    
1. gDNA 추출 키트가 필요하고 특정 유전자를 얻기 위해서는 PCR을 해야할 것입니다.
2. 일반적인 클로닝을 위해서는 제한효소, alkaline phosphatase, ligase가 필요합니다.
3. competent cell, selection media이 필요하고 transformation 방법에 따라 electroporator나 heating bath등이 더 필요합니다. 
깔끔  |  2018.02.11    
 저도 비슷한 실험을 하는데 국내 진올브랜드의 KIT를 추천합니다. 샘플 키트도 주니깐 진올에 물어보세요
꽃개구리Applied_Microbe  |  2018.02.12   
 1. 박테리아 gDNA(플라스미드가 아닌)에서 특정 유전자를 포함한 부분 추출
어떤 박테리아 (그람 양성, 그람 음성, 포자, 협막 등)이냐에 따라서 좀 다릅니다. 기존의 gDNA extraction kit 들은 그람 음성 박테리아는 잘 됩니다. 그러나 그람 양성, 포자, 협막 등은 잘 안됩니다. 그람양성의 경우에는 gDNA extraction kit의 그람양성 박테리아 protocol을 그대로 하는 것 보다 양간 변형해서 진행하셔야 gDNA extraction 수율이 높습니다. (제 경험상)
대부분의 키트들이 다 비슷비슷합니다. 다만 NGS용은 수율과 gDNA의 quality가 좋지만 가격이 무지 비싸고 부수기자재들이 많이 들어 갑니다. 단순한 cloning목적의 gDNA 추출이면 그냥 주변에서 사용하는 키트 사다가 쓰시는 것도 나쁘지 않습니다.
그람음성의 경우에는 gDNA extraction 없이 그냥 전자렌지를 이용해서 boiling 후 PCR을 해도 target DNA를 얻을 수 있기는 합니다. 

gDNA를 추출했으면 그 중에서 원하는 유전자를 증폭 추출해야 하는데.... primer design은 직접 하셔야 할 것 같습니다. 유전자 증폭용 PCR kit는 master mix kit (다인바이오, 인트론, 바이오니아, 라보패스 등)를 사다가 쓰시면 되는데.. 거의 비슷비슷합니다. 큰 실수 없으면 증폭됩니다. 다만 primer design과 PCR 조건에 따라서 결과에 문제가 생길 수도 있습니다.    

2. 다른 플라스미드에 유전자를 이어 붙임
다른 플라스미드가 어떤 것인지에 따라 다르겠지만... 클로닝해서 대장균에 transformation하는 목적이라면 TA cloning vector 사용하시는 것이 좋겠네요... invitrogen의 TOPO TA cloning vector도 있고 Promega의 pGEM t-easy vector도 있습니다. pGEM t-easy vector가 가장 무난할 것 같네요

3. 재조합한 플라스미드를 대장균에 도입 
competent cell을 만들어서 쓰실 수도 있지만 상품화되어 있는거 쓰시는 것이 좋겠네요. 동인바이오텍에서 취급하는 Hit competent cell이 초보자들에게는 좋은것 같습니다. 가격도 저렴하고요.... 그리고 항온수조와 ice maker가 필요합니다. (Ice maker가 없으면 빙수용 분쇄기와 각얼음 준비하셔서 사용해도 됩니다. )
LB broth/LB agar는 어차피 만들어서 사용하셔야 할 것 같습니다. 아니면 생배지 제조업체에 문의하셔도 됩니다. 최소수량이 50개 입니다. 지속적으로 사용하는게 아니라면 건조배지 사다가 쓰는 것보다 경제적입니다.  X-gal과 IPTG, ampicillin이 있어야 합니다. (검색창에 '미생물 생배지'라고 검색해보면 몇개업체가 나옵니다.  거기에 X-gal과 IPTG, ampicillin 첨가해서 만들 수 있는지 가격은 얼만지 물어보세요 )

Trasformation이 성공했다면 plasmid isolation kit (다인바이오, 인트론, 바이오니아, 라보패스 등 다 비슷비슷합니다)를 이용해서 plasmid 추출 후 DNA sequencing (코스모진텍, 바이오니아 등)을 의뢰해서 확인해보세요. pGEM t-easy vector라면 plasmid 만 보내고 sequencing용 primer는 분석회사에서 제공합니다.



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