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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 sequencing 앞부분 안읽히고 뒤쪽은 깨끗하게 읽히는..
앞다리arimari(대학생)  | 2018.02.07 17:24
첨부파일 파일첨부: P_For.jpg (154 KB)
이미지 첨부파일
  blood에서 RNA prep후 cDNA 합성해서 PCR 진행했는데요
primer도 여러번 check 했고 하는데..

control로 사용하고 있는 cDNA에서 계속 2band가 나와서요
실험군으로 제공받은 RNA는 1 band 떴습니다..
2band 뜬게 이상해서 direct sequencing을 해보았습니다.

근데 저는 처음보는 양상이더라구요
보통 in/del은 잘 읽히다가 중간부터 mixed peak 뜨는데요

제 결과는 For, Rev 둘다 앞부분은 지저분하고 중간 부터 깨끗해져서 읽힙니다
방향성도 확인 했습니다.
여러번 재실험 했는데 동일한 site에서부터 저래요
엑손 - 인트론 바운더리가 아닌 엑손의 중간부분입니다. For, Rev 모두..

cDNA합성 과정은  다른 샘플은 괜찮게 나와서 문제되는 것 같지 않은데요
RNA prep 과정에 문제가 있는 것 일까요?
control들만 blood에서 prep하고
실험군은 RNA상태로 제공 받았거든요

이런 경험 있으신 실험 고수님들 답변 부탁드립니다


#sequencing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  2018.02.07   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
DNA 두 종류가 섞여 엤군요.
하나는 150 + a 길이의 DNA이고 또 하나는 좀 더 긴 DNA 것이 섞여 있어요
앞다리arimari  |  2018.02.08   
 역시 강시님 답변감사해요 !!

그니까 섞여있어서

150~160 까지 같이 읽혀서 지저분한거고 그 다음부터는 잘 읽힌거군요?!!

human reference RNA 사용해보니 동일하게 2band 가 뜹니다

그렇담 RNA prep 과정 문제는 아닌 것 같은데

잘 읽힌 부위 분석해보면 exon끼리 잘 붙어 있어요

cDNA 합성도 문제로 보이진 않는데 ..

그럼 primer가 non specific으로 붙어 그런 결과가 나온걸까요?

실험군 RNA는 워낙 농도도 낮았고 소량이라 1band만 나온 걸까요?ㅠㅠ
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