제한효소 처리 후, extraction하지 마시고 그냥 10mM dNTP 1ul와 Klenow fragment 1ul(1-10 unit) 넣고 상온에서 10분 반응시키세요.
그 다음 gel extraction하시던가 DNA purification하시면 됩니다.
DNA가 없어지는 경우는 DW, dNTP, buffer 또는 klenow fragment가 exonuclease에 오염된 경우입니다. 다 새로운 시약으로 바꿔서 해 보세요.
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레벨1
또뚜집사
(대학원생)
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18.02.02 14:16
아 그렇군요!
저도 오염의 문제라 생각이 들어 하나씩 바꿔보았는데
제한효소 후 바로 klenow 처리는 생각 못했습니다 ㅠ_ㅠ
그럼 EDTA로 불활성화 할 필요없이 바로 Klenow 후 gel extraction 과정을 거치면
되는건가요 선생님?
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미국포닥
(비회원)
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18.02.03 10:19
안녕하세요? 뚜뚜집사님
고생이 많으시네요. ㅎㅎ 근데 제가 몇 가지 짚어줄 곳이 보입니다.
우선 블런트엔드 클로닝은 가급적 피하시구요. 아시다시피 스티키엔드보다 라이게이션효율이 무척 떨어지고 인서트 방향에 대한 예측이 불가해 콜로니를 스크린할때도 더 손이 많이 갑니다.
그래도, 굳이 블런트엔드를 써야할때는 클리나우가 아닌 T4 DNA polymerase를 사용하세요. 두 효소다 DNA 끝을 블런트로 만든다는 것은 같으나 중요한 차이가 하나 있습니다. klenow는 strand displacement 즉, 반응동안 overhang이 있는 곳만 채우는게 아니라 원래 double strand DNA 전체를 새로 만들어 버립니다. 따라서, 반응시간이나 dNTP등이 충분하지 않으면 불완전한 DNA를 만들어버리게 됩니다. 보통 인서트는 작기 때문에 klenow를 써도 큰 문제가 되지 않지만 벡터는 크기 때문에 불완전한 반응 또는 mutation 등이 일어나기 쉽습니다. 이에 반면 T4 DNA polymerase는 전체를 새로 만드는게 아니라 overhang부분만을 채워주기때문에 효율이 높고 불완전한 반응이 될 가능성이 낮죠. 따라서, 블런트엔드로 클로닝을 할때는 이걸로 해야합니다. klenow는 정말 아주 가끔 쓰이는데 DNA probe을 만들때 좀더 많은 nucleotide에 isotope labeling를 요할때만 쓰입니다.
끝으로, blunt end ligation 보다는 Gibson assembly (지금은 Hifi assembly)를 써보세요. PCR로 인서트를 증폭해야 한다는 단점이 있지만, 사실 뭐 그다지 큰 문제가 아니고, 효율이 아주 높고 방향을 선택적으로 할 수 있어서 아주 유용합니다.
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레벨1
또뚜집사
(대학원생)
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18.02.05 10:29
안녕하세요 미국포닥님!
포닥님의 친절한 답변에 많이 배우고 갑니다ㅠ_ㅠ!!!!
저도 블런트엔드 클로닝을 피하고싶었으나, Vector를 제작하는 과정에서 그 뒤의 insert까지
고려하고, Vector의 enzyme도 제한적이다보니 피할 수 없는 선택이었습니다..흑흑ㅠ_ㅠ
앞전 선배들이 klenow를 쓰다보니 T4 DNA polymerase는 생각만 하고 실제로 실험하지않은
저의 잘못이라고 생각합니다ㅠㅠ. 제가 알기 쉽도록 설명주셔서 정말 감사합니다.
바로 T4 구매하여 진행해보도록 하겠습니다!
혹시 제가 하고 있는 실험과정에서 여쭈어보아도 될까요~?
Klenow 처리 후에 EDTA과정을 거치지않고, Gel extraction을 진행하는데
EDTA로 불활성화 하지않고 바로 Gel extraction을 해도 문제가 되지않을까요?~
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미국포닥
(비회원)
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18.02.05 12:41
보통 gel extraction을 하게 되면 거의 대부분의 효소들은 제거된다고 보시면 됩니다. 클리나우도 제거될거라 생각합니다. 문제는 gel extraction에서 온게 아니라 제가 설명드린 상황에서 일어난게 거의 틀림없습니다. EDTA나 Heat을 통한 효소를 불활성화할 경우는 gel extraction을 하지 않고 그 다음 단계로 넘어갈시 그 전 반응의 효소가 문제가 될 경우에 하는 방법입니다. 하지만, EDTA를 넣게 되면 그 다음 단계에서 효소의 활성화에 영향을 미치는 경우가 많으므로 주의하셔야 합니다.
위의 클로닝은 정말 미치도록 급하신게 아니라면 T4 DNA polymearase 올때가지 참고 기다리세요. ㅎㅎ
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레벨1
또뚜집사
(대학원생)
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18.02.05 14:04
미국포닥님 정말 감사드립니다ㅠ.ㅠ
몇달째 막힌 cloning이라 이래저래 trouble shooting 이 많이 해봤거든요..
정말 힘들어서 놓아버리고싶을정도였습니다 ㅠ_ㅠ
이 vector만 제작하는거면 괜찮은데
blunt cloning 으로 vector 제작 후 insert를 다시 넣어야해서
많이 막막했습니다.
선생님 조언대로 T4 사용해보겠습니다! 감사합니다 !