안녕하세요 고수님들께 조언을 얻고자 질문을 남깁니다. 저는 지금 새로 박사과정을 시작하면서 로테이션 중인데, 새로 생긴 실험실에서 혼자 작은 실험들을 해내고 있습니다. 그 중 하는 것이 10kb 정도 되는 (pLV 혹은 pcDH) 템플릿에서 아미노산 하나만 바꾸는 SDM 을 하고 있습니다.
quikchange ii XL 로 하나의 SDM 은 성공했는데, 그 후로는 quikchange ii 로 진행하고 있습니다. 모든 것을 스탠다드 프로토콜을 따라서 거의 변형 없이 진행을 하였습니다. template 50ng, primer 125ng, 온도 시간 그대로. extension 10min (1kb/min) , cycle 18, 등등.. 프라이머도 매뉴얼로 계산해서 더블체크 했기 때문에 괜찮은 것 같습니다.. 25~27mer 에 78 도 이상..
다만 transformation 에서는 키트 제공 strain을 사용하지 않고 oneshot-stbl3 / top10 을 교대로 사용하여 transformation 하였습니다. 50ul reaction 중에서 5ul ~ 10ul dpnI 처리된 DNA을 50ul comp cell 에 transformation 하였고, 결과는.... 콜로니가 전혀 나타나지 않고 있습니다.
아직 셋업이 아직 완료가 안되어서 gel 을 내려서 reaction 상태를 보고 싶은데, 교수님께서 물려받은 공간에 etbr gel 시스템 밖에 없어서 그냥 이 과정은 사이버세이프가 올 떄까지 넘어가자고 하셨습니다. 그래서 약간 주먹국구식으로 하고 있긴 한데, 사실 dpnI 처리 후 그냥 transform 하는 경우가 많아서 별로 중요하게 여기지 않았는데, 콜로니가 하나도 생기지 않으니 해야 한다고 생각이 드네요...
말이 길었는데, 선배님들께 여쭤보고 싶은 질문은 다음과 같습니다.
1. 10kb 정도의 SDM 에 quikchange ii 와 ii XL 의 효율 차이가 큰지, 지금이라도 빨리 새로 xl 을 주문하는게 나을지 .. (혹은 lightening 을 사버릴까..) 돈이 돈인지라, 로테이션 학생이 함부로 material 을 구매하는게 눈치가 보입니다. ㅜㅜ
2. quikchange reagent 사용시, 보통 50ul reaction이 제시되어 있는데, 제가 중국인 포닥 분께 처음 sdm 을 배웠을 때는, 20ul reaction으로 scale down 해서 하더라구요. 저는 그 스케일로 겁이 나서 하지 않았지만, 혹시 reagent 아끼시려고, 그렇게들 많이 쓰시는지 궁금합니다. 조심히 실험하는 대신 아껴 쓸 수 있다면 하는게 좋을 것 같습니다.
3. transformation 하실 떄, comp cell volume 과 dna volume 을 10:1 ~ 20:1 정도로 하는걸로 알고 따르고 있는데 5:1 도 괜찮나요? 선배님들 경험상 이게 중요한 스텝인가요?
4. 보통 comp cell 주문해서 쓰시나요 만들어서 쓰시나요. 실패를 많이 할 거 같은데 커머셜 comp cell 들을 뭉텅뭉텅 낭비하니깐 다른 방법이 있따면 찾아야 할 것 같아요.
5, (논외) Stbl3 strain이 보통 lb 에서 잘 안자라는 것 같은데, low salt나 2x LB로 키우면 잘 자랄까요? 5ml miniprep 으로 16hr culture시 100ug/ul 나옵니다..(먼산..)
아 정말 로테이션 들어가는 곳마다 dna work으로 스트레스 너무 많이 받네요ㅎㅎㅎ 이런 시행착오는 평범한 거겠죠..? 아무튼 답변 해주시면 정말 감사드리겠습니다.