IB로 나온 단백질을 denature 한다음 refolding 해서 Ni-NTA column에 걸어 정제 하시려는 건가요? (제가 제대로 이해하고 있는지요 ^^;)

먼저 Ni-NTA(Qiagen)를 사용한다고 했는데 굳이 PBS로 가야할 이유가 있는지요 오히려 Tris 버퍼에서 더 잘 working한다고 생각하는데요. 저도 qiagen거 많이 사용하고 Tris 버퍼에서 무난하게 잘 쓰고 있습니다.

그 다음으로 리폴딩한 단백질이 버퍼 교환시 aggregation 된다고 하셨는데 저도 같은 경우가 있었습니다. 그땐 Tris 버퍼로 refolding한뒤 GST 걸려고 PBS로 버퍼 교환했는데 그냥 뭉처버리더군요. 이경우는 막말로 케이스 바이 케이스인거 같이서 답해드릴 수 없을 거 같습니다. 아니면 리폴딩의 문제인데 이부분은 저도 지식이 잘 없어서 답은 못드리겠네요.(전 그때 그냥 transformation을 다른cell로 다시해서 진행했습니다.)

지아짱님 경우에는 그냥 무난히 Tris 버퍼에서 Ni-NTA 걸으시면 될 듯합니다.

Urea를 빼주면서 Tris buffer로 모두 change가 된 건 가요?

refolding자체가 서서히 Urea가 빠지면서 되는건데

완전히 Urea를 제거하기는 매우 힘들다고 봅니다.

그냥 Tris라고 해도 어느정도 Urea는 함유하고 있다고 봅니다.
(이때 salt는 inclusion body 녹일 때 사용했던...)

오랜 시간에 거쳐 많은 양의 버퍼를 바꿔 주면서 수행했다면 모를까...

또 그 단백질이 S-S 결합이 많을 수록 그 영향을 더 많이 받죠

어쨌든 Urea가 완전히 빠지지 않으면

Urea같은 것이 전혀 들어 있지 않은 PBS와 buffer change가 될 때

aggregation이 생길 수 있다고 생각합니다~

어디까지 제 생각이니 참고만 살짝 하세요^^

급격한 buffer change는 쥐약입니다.
내성이 있는 단백질들도 있지만 그렇지 못한 경우가 더 많습니다.

Tris와 PBS는 성질이 완전히 다른 buffer입니다. 만약 chagen를 하시고 싶다면 아주 조심스럽게 조금씩 해주어야 합니다. Dialysis를 할때도 꼭 고려해야 하는 사항이 buffer change입니다.

고수님들 답변감사합니다.
다시 또 시작해야겠네요 ㅎㅎ