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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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질문 RNA extraction 시 문제...
뒷다리cell40(과기인)  |  2017.12.08 11:55
안녕하세요? 
qPCR을 하기 위해 RNA extraction을 하는데 문제가 있어서 질문 드립니다.

우선 지난번에도 trizol을 이용하여 RNA extraction을 하였는데 특별한 문제는 없었습니다.
그런데 오늘 다시 RNA extraction을 하는데
몇몇 sample에서는 phase separation이 거의 전혀 되지 않았습니다.
Phase separation이 된 sample에서도 이전보다는 상층액에 clear 하지 않았습니다.

이전과 차이점이라면 
plate에서 media를 suction 하고 나서 PBS washing을 하지 않았습니다
(RNA만 extraction 할 때에는 꼭 필요치 않다고 들어서요).
그리고 cell confluency가 이전보다는 높았습니다만 그래도 80-90% 정도라고 생각됩니다.

즉 cell confluency가 높은 plate에서
PBS washing 없이 trizol 만으로 lysis 시켜 centrifuge를 했더니
phase separation이 전혀 되지 않았고
centrifuge를 더 해도 차이가 없길래
상층액만 딴다는 기분 (?)으로 일단은 끝까지 RNA를 뽑아 보았는데요.
A260/280은 1.4-1.8 (제일 잘 나온 것이 1.8)
A260/230은 훨씬 낫게 1 초반까지도 나왔습니다.
RNA 농도 자체는 1000 ng/ul 이상으로 전부 고농도였습니다.
Cell은 plasmid, shRNA 등이 transfection 되어 있는 mammalian cell로서
이전에도 이 cell로 RNA extraction을 하였습니다.
시약은 모두 새것 (실험실용), 마스크 장갑 등 오염에 주의하면서 실험했습니다.

샘플 퀄리티가 qPCR을 할 수는 없을 것으로 생각돼서 
PBS washing을 하고 다시 뽑아볼 예정이기는 한데
왜 몇몇 샘플에서 phase separation이 안 되었는지 궁금합니다.
Phase separation이 안 되었기에 상층액을 딴다고 땄지만 phenol이 섞여 있었고
그래서 A260/280, A260/230이 낮게 나온 것이 아닌가 생각되어서요.

읽어주셔서 감사합니다.

#RNA
 
#trizol
 
#A260/280
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Marine  |  2017.12.08   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
조직또는세포가 Trizol 이 lysis 할 수 있는 capacity 를 넘을정도로 많게 되면 말씀하신 것처럼 
Phase seperation 이 잘 되지 않고 Purity 가 낮게 나옵니다.

 기존에 쓰시는 것보다 Trizol 을 더 늘려서 써 보시는 것을 추천드립니다.
1000ng/ul 이면 양은 차고 넘친다고 생각됩니다. 1.5 배 내지는 두배 까지 늘려도 좋을 듯 하네요. 또는 Cell 양을 줄여도 되구요.


뒷다리cell40  |  2017.12.09   
Marine님 답변 감사드립니다.
10 cm plate에 1 mL을 넣었었는데 아무래도 cell이 너무 많았나 봅니다.
Cell debris가 보이더라고요.
Trizol을 많이 쓰기가 부담스러워서 1.5 mL만 넣어서 해봤는데 그럭저럭 잘 나온 것 같습니다 ^^
또한 검색을 해보니 pipetting이나 vortexing도 좀 더 잘해줬어야 했던 것 같아서
그 부분에도 신경 썼습니다 (저같은 초보자가 나중에 답변을 볼 수도 있어서 적어봅니다 ^^)

감사합니다!!!
kyongshin  |  2017.12.11    
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
안녕하세요


ZymoResearch한국 공식 대리점인 경신과학(주)입니다.


작성자님처럼 RNA가 뽑혔는데, Purity는 안좋고.. 그런데 샘플은 버리기엔 기존에 처리했던 과정이 길고 복잡했기때문에 망했다 싶을때가 있을텐데요,


그럴때는 Spin Column형식 kit중 RNA clean up kit를 사용하실 수 있습니다.일반적으로 RNA외 다른 Purity에 지장을 주는 성분이나, nt등을 제거해주는 제품군입니다.


ZymoResearch에는 해당제품군은 RNA Clean & Concentrator(http://www.zymoresearch.com/rna/rna-clean-up/rna-clean-up-concentration/rna-clean-concentrator-5) 를 참고하시기 바랍니다.
뒷다리cell40  |  2017.12.11   
kyongshin님, 제품 정보 감사드립니다 ^^
문제가 반복될 경우 사용하는 것을 고려해 보도록 하겠습니다.
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