실험 Q&A Chemical biology > Analysis
pfu PCR 문제입니다
실험실초보 (비회원)
장마철에 연구에 몰두 하신다고 수고많으십니다. 이번에 gene cloning을 새로하게되서 orf PCR을 새로 하고 있습니다. taq으로 PCR을 해서 sequencing을 보내니 mutation이 많아서 pfu로 새로 pcr을 확인하고 있습니다. 문제는 taq으로 나오는 750bp 밴드가 pfu를 쓰는 순간 안보이는 것인데요 사용한 primer는 각각 EcoR1과 Sal1을 붙이고 dummy sequence는 붙이지 않았습니다. 5''- GAATTC ATGACAGGCATCGCCG -3'' 5''- GTCGAC TTATTGCTGCATCTTC -3'' 각각 Tm 값은 약 62,58도 정도이고, 얻을려고 하는 PCR product는 750bp 정도입니다. taq으로 pcr시엔 primer 농도는 10micromol씩 사용하였으며, 그외 농도는 taq product sheet와 동일하게 사용하였습니다. 94도 5분-(94도 30초,60도 30초,72도 30초)30cycle-72도 5분-4도 hold였습니다. pfu로 pcr 수행시 primer 농도는 위와 동일하였으며, 그외 농도도 pfu product sheet와 동일하게 사용하였고, 이때 사용된 pfu는 enzynomics npfu 였습니다. pcr condition은 95도 2분 - (95도 30초, 60도 30초, 72도 1분)30cycle - 72도 5분 - 4도 hold 를 기본으로하여 초반, denaturation time을 2분에서 5분으로 늘려보기도 하였으며, annealing 온도를 5도 단위로 40도 까지 낮추어도 봤으며, extension 온도도 2분까지 늘려보았습니다. 또한, template를 의심하여 새로운 것을 사용하기도 해보앗으며, primer도 새것으로 교체를 수행하였습니다. 각기 다른 방법으로 pfu pcr 수행시에 모두 750bp가 아닌 약 400bp의 밴드만이 나오는데요. 이 문제점을 해결할 수가 없어서 이렇게 글을 올립니다. 이 문제 덕분에 pcr 개념을 처음부터 새로 공부하게 되어서 좋기도 하지만 답답한;; 제가 다음에 해보고자 하는 것은 1) extension 온도를 68도 까지 낮춘 pcr 2) 일단 taq을 이용 5cycle 정도 pcr 수행 후, pcr product purification 이후 pfu 이용한 pcr 3) template이 cDNA library 라서 vector insert 부분이 다 들어가는 m13 primer를 이용 pfu nested pcr 수행이후, 이 product를 template로 하여 pfu orf pcr 수행 정도 입니다. 고쳐야할 부분이 있다면!! 거침없이 지적해주시고 많은 조언 부탁드리겠습니다.
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