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질문 pfu PCR 문제입니다
실험실초보  | 2008.06.25 12:06
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
장마철에 연구에 몰두 하신다고 수고많으십니다.

이번에 gene cloning을 새로하게되서 orf PCR을 새로 하고 있습니다.

taq으로 PCR을 해서 sequencing을 보내니 mutation이 많아서 pfu로 새로 pcr을 확인하고 있습니다.

문제는 taq으로 나오는 750bp 밴드가 pfu를 쓰는 순간 안보이는 것인데요

사용한 primer는 각각 EcoR1과 Sal1을 붙이고 dummy sequence는 붙이지 않았습니다.

5''- GAATTC ATGACAGGCATCGCCG -3''
5''- GTCGAC TTATTGCTGCATCTTC -3''

각각 Tm 값은 약 62,58도 정도이고, 얻을려고 하는 PCR product는 750bp 정도입니다.

taq으로 pcr시엔 primer 농도는 10micromol씩 사용하였으며,
그외 농도는 taq product sheet와 동일하게 사용하였습니다.
94도 5분-(94도 30초,60도 30초,72도 30초)30cycle-72도 5분-4도 hold였습니다.

pfu로 pcr 수행시 primer 농도는 위와 동일하였으며, 그외 농도도 pfu product sheet와 동일하게 사용하였고, 이때 사용된 pfu는 enzynomics npfu 였습니다.

pcr condition은
95도 2분 - (95도 30초, 60도 30초, 72도 1분)30cycle - 72도 5분 - 4도 hold
를 기본으로하여
초반, denaturation time을 2분에서 5분으로 늘려보기도 하였으며,
annealing 온도를 5도 단위로 40도 까지 낮추어도 봤으며,
extension 온도도 2분까지 늘려보았습니다.
또한, template를 의심하여 새로운 것을 사용하기도 해보앗으며, primer도 새것으로 교체를 수행하였습니다.

각기 다른 방법으로 pfu pcr 수행시에 모두 750bp가 아닌 약 400bp의 밴드만이 나오는데요. 이 문제점을 해결할 수가 없어서 이렇게 글을 올립니다.

이 문제 덕분에 pcr 개념을 처음부터 새로 공부하게 되어서 좋기도 하지만 답답한;;

제가 다음에 해보고자 하는 것은
1) extension 온도를 68도 까지 낮춘 pcr
2) 일단 taq을 이용 5cycle 정도 pcr 수행 후, pcr product purification 이후
pfu 이용한 pcr
3) template이 cDNA library 라서 vector insert 부분이 다 들어가는 m13 primer를
이용 pfu nested pcr 수행이후, 이 product를 template로 하여 pfu orf pcr 수행
정도 입니다.

고쳐야할 부분이 있다면!! 거침없이 지적해주시고 많은 조언 부탁드리겠습니다.
#pfu
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리코스모진텍  |  2008.06.25   

다른 pfu를 사용하시는게 좋을 듯 싶습니다.

750이 아니라 400에서 나오는 것을 보면 extension시간이 짧았다고

생각하는데, 2분까지 늘려서 안되었다고 하시니...pfu를 바꾸시는게

좋을 듯 싶네요. 아래 조건에서 다시 안되면 정말 바꾸시는 것을

권고합니다.

95도 5분 - (95도 30초, 55도 30초, 72도 2분)30cycle - 72도 5분


실험실초보  |  2008.06.25    
코스모님 답변 감사드립니다.

코스모님께서 알려주신 pcr condition은 이미 수행해보았습니다.
이때도 마찬가지로 400bp 밴드만이 보였으며,
npfu//dNTP//pcr buffer도 동일 회사 새것으로 교체하여 pcr을 수행하였을때도 마찬가지였습니다.

지금 stratagene에서 나온 pfu를 사용할려고 하는데, 회사마다 다르게 나올 수 있는지 궁금하고, 이때도 마찬가지로 안나온다면 primer를 더 길게 30mer 정도로 제작한다면 어떨지 여쭈어 봅니다.
대왕개구리엘피스  |  2008.06.26   
Pfu는 회사마다 clone이야 같겠지만 buffer조성이라던다, 또는 Pfu의 정제도라던가 하는 것에서 미세한 차이를 보입니다.

Pfu는 Taq에 비해 processicity가 많이 떨어집니다. 이 문제를 보와하고자 다양한 Pfu와 또는 이에 상응하는 다른 균주의 enzyme들이 지금도 많이 개발되고 있습니다.

Template를 좀 늘려 사용하시면 결과를 보실 수 있을 것으로 생각됩니다.

그리고 S사의 Pfu에는 Pfu의 활성에 도움을 주는 cellular extract가 첨가되어 있어 Pfu의 가장 큰 단점인 processivity를 보완해 주고 있기 때문에 좋은 결과를 얻으실 수 있을 것으로 보여집니다. 하지만 가격이 센게 흠이죠.
개구리코스모진텍  |  2008.06.26   
. 회사마다 다르게 나올 수 있습니다. 물론 미세할 수도 있고, 차이가 날 수도

있습니다. 그리고, 다시 priemr를 제작하시는게 나을 듯 싶습니다.

그 이유인 즉, Sal1의 sequence에 dummy sequence를 붙이지 않으셨는데,

이런 경우 낭패를 볼 수가 있습니다. 예전에 이런 낭패를 보지 않았기 때문에

괞찮다라는 인식이 있을 수 있습니다. 3개정도는 붙이시길 권고합니다.

EcoR1의 경우 1개 정도는 붙이시길권고 하구요. 물론 EcoR1이 참 잘 잘리기는

하지만요. primer가 본래의 sequence 부분에 450bp에 붙을 수 있는지 확인은

하셨으리라 믿습니다. 혹, 모르니 한두개 다른 염기서열이 있어도 붙을 수

있는 가정이 있으니깐요.

말이 자꾸 길어져서 간단히 요약하면요.

1. pfu는 회사마다 다를 수 있고, 확실하게 test를 하고자 하시면
동일한 조건에서 pfu가 아닌 일반 taq으로 pcr을 해 보세요.

2. 이러한 조건에서도 450bp가 계속 증폭이 된다면 primer를 조절하는 것도
좋은 방도라 생각합니다.

3. stratagene이라는 이름 값이 있지만, 국내회사의 pfu도 좋습니다.
물론 pfu의 대한 논문, 실험, fidelity에 대한 것을 찾으면
stratagene이 한 몫 하고 있기는 하지만요. 저의 경우 stratagene pfu
많이 해보지는 않았지만, amplify는 그리 좋지는 않더라구요. 제 실험의
제 sample의 경우에 말이죠.

얼릉 성공하시길요^^
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