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조회 3947
Enzyme cut 진행시 DNA 농도가 어느정도 떨어져야 하나요??
무무무무
(과기인)
|
2017.11.13 17:52
432ng/ul plasmid를 60ul
enzyme
cut
진행했고 clean up 하고 nanodrop 재니까 284ng/ul이 나왔고, 동시에 248ng/ul DNA fragment를 30ul 진행하니까 72.8ng/ul로 나왔거든요....
농도가 너무 많이 떨어진 것 같은데 제가 실험하면서 뭔가 실수가 있었을까요...?
#Enzyme cut
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강시
|
2017.11.14
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처음에는 DNA 양을 말씀하시고,
그 다음에는 농도만 말씀하시는군요.
그래서야 DNA 양이 줄었는지 늘었는지 알지 못합니다.
DNA
cut
을 하면 nonspecific DNase가 오염된게 아닌 이상 DNA 양이 줄지 않습니다.
아마 clean up할때 DNA를 날렸겠죠.
그래봐야 보통 한 10% 정도 날리기는 합니다만.....
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판다의브레인
|
2017.11.14
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Clean up 과정에서 loss가 있는것은 맞는것 같은데,
실험자께서 모든 공정을 문제 없이 진행했다는 전제 하에
(예를들면 elution시 DNA와 solution(물이나 elution buffer)의 반응시간을 2분이상 주었다던지..)
Enzyme
cut
ting을 한뒤에 왜 농도를 재려고 하셨는지 궁금하네요.
이후에 Ligation을 하시려고 비율을 맞추려 한것이라 생각하겠습니다.
분명 좋은 방법은 아닙니다.
저 같은 경우는 nano drop을 100% 신뢰 하지 않습니다..
DNA가 linear하게 되어 있는 상태와 DNA 가 circular form이 되어있는 상태에서의 농도는 당연히 다르게 측정된다고 생각합니다.
예를들면 PCR을 한뒤에 DNA의 농도를 nano drop으로 측정해보세요.
이상하게 Agarose gel에서는 찐하게 나타나는 밴드가 농도를 재보면 이상한 25ng/uL등 낮게 나타납니다.
DNA work을 잘하시는 분들은 nano drop을 사용하지 않고 Gel을 내려서 확인합니다.
Gel에서 보이는 밴드의 세기에 따라서 농도를 판단하는 것이죠(물론 DNA size에 따른 밴드의 세기도 고려해야합니다.)
정 의심이 가신다면 같은 Volume으로(농도가 아니라)
Enzyme
처리하기 전 후 Clean up 후 를 내려보세요. 갈수록 어느정도 loss가 일어나는지 알수 있습니다.
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