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질문 tyrosinase inhibition 실험 질문입니다!!!!
개구리학부연구생(대학생)  |  2017.11.11 22:51
 tyrosinase inhibition 실험을 하고 있는 학부연구생입니다. 계속해서 -값이 나와서 도움을 받고자 합니다. 선배님들, 부디 도와주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ

제 프로토콜은 다음과 같고, 제 스스로 다른 문헌들 참고하면서 만들었습니다. 

Reagents

1. 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) : According to PBS pH table, 1M monobasic(NaH2PO4, MW : 119.98, SIGMA S3139-500G) 510 mL + 1M dibasic(Na2HPO4, MW : 141.96, AMRESCO 0404-1KG) 490 mL

mono 3.06 g/ 510 mL + di 3.479 g/ 490 mL adjust pH to 6.8 with monobasic or dibasic

2. 5 mM L-DOPA in 50 mM PBS : 0.00985 g/10 mL (MW : 197.19, SIGMA D9628-5G)

3. 2 mM L-tyrosine in 50 mM PBS : 0.00362 g/10 mL (MW : 181.19, SIGMA T3754-50G)

4. arbutin (Positive control) : final con. 50 ug/mL (MW : 272.25) in 50 mM PBS

5. 110 units/ml mushroom tyrosinase : 2687 units/mL (SIGMA T3824-25KU) 시약 1 mg + 24.5 mL 50mM PBS on ice, stored at -20

6. sample : 3.1, 6.2, 12.5, 25, 50, 100, 200 & 400 ug/mL in 50 mM PBS

 

Protocol(#1 L-DOPA)

1. sample 100 , 110 U mushroom tyrosinase 50 , 50 mM sodium phosphate buffer 20 를 각각 넣고 37 에서 5분간 pre-incubating
2. 5 mM L-DOPA sol. 30 를 추가적으로 넣고 37 에서 10분간 incubating
3. 475nm에서 O.D값 측정
4. 활성 저해율 계산

Inhibition activity(%) = (1-(sample OD-blank OD)/(control OD-blank OD)) *100

여기에서 질문입니다.
1) 인큐베이팅을 세포를 키우는 인큐베이터(온도,습도조절)에서 했더니 96well에 습기가 차서 흡광도 CV값들이 30을 웃돌던데 영향을 받은 것이 맞나요? 다른 실험에서도 저렇게 CV값이 높게 나온 적은 없습니다...

 1-1) 그렇다면 어떤 인큐베이터에서 해야하나요? 습기없이 온도만 조절되는 기구가 따로 있나요?

2) 실험중에 사용 된 L-DOPA와 arbutin 이 stock이어서 녹여서 사용을 했는데, 예전에 선배가 실험하던 것이어서 어디에 녹였는지를 모릅니다. 제 프로토콜은 50 mM PBS 에 녹여야 했는데 만약에 stock이 50 mM PBS에 녹아있는 것이 아니라면 절대 사용하면 안되나요? 그리고 다른 용매, 다른 농도에 녹아 있는 것이 큰 영향을 주나요?


3) PBS를 만들기 위해 찾던 중에 큰 혼란이 왔었습니다...어느 글은 NaCl, KCl 로 적정해야한다고 하고 어떤 글은 오로지 mono, dibasic으로만 해야한다고 하고..일단 저는 mono, dibasic으로만 pH를 맞췄는데 맞게 PBS buffer를 만든건가요? 보통 pH맞출 때처럼 HCl, NaOH로 맞춰서는 안되나요?


4) 마지막으로, sample dilution에 관한 영상을 본 적이 있는데요. stock을 96well에서 옆으로 옮기면서 희석하는것과 e-tube에다가 각각 dilution 따로 하고 96well에다가 옮겨 실험하는 것과 어떤 것이 더 효율적인가요?


이 실험을 제가 제대로 마무리하지 못해서 실험실에 누만 끼치고 있습니다..부디 선배님들의 도움으로 제가 무사히 마무리지었으면 합니다. 도와주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ

 

#tyrosinase inhibition
 
#프로토콜
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