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피부실험좀잘됐으면
(비회원)
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17.11.08 00:26
1) 대조군보다 독성 group 이 더 떨어지는 현상이 정상인가요? 만약 정상이라면, 어떤 값에서 저 값들을 뺀 값을 data로 사용해야 할 것 같은데
(저희 랩에서 나온 data 들은 독성군에서 값이 증가했고, 졸업하신 분은 background 를 따로 둔 후 background 에서 저 값들을 뺐다고도 하더군요... 만약 저게 정상이라면 어떻게 처리한 group 을 background 로 잡아야할지 모르겠습니다)
- DCFH-DA assay의 경우는 독성을 보는 실험이 아닌 산화적 스트레스(ROS)가 얼마나 유발이 됐고 샘플 처리후 얼마나 감소하였는지 확인하는 실험입니다. 원래의 경우는 스트레스 처리를 안한 군보다 스트레스 처리한 군이 2배 이상~ 크게는 10배까지도 상승합니다. 실험에 있어서 오류가 보이는데, 우선 스트레스 처리 농도가 매우 높아서 세포 자체가 죽어 세포와 DCF-DA시약과 반응을 하지 않아 상대적으로 값이 적어 보이는 경우로 보입니다. DCFH-DA 실험의 경우는 intracellar oxidative stress를 보는 실험이거든요. 그리고 DCF-DA 용액의 경우 media에 섞어서 실험하셨는데, 이는 washing을 제대로 하지 않을경우 media의 간섭으로 인해 실험이 제대로 되지 않을 가능성이 높습니다. seeding과 샘플 처리 이후 DCF-DA처리 및 스트레스 처리는 HBSS와 섞어서 처리해보시길 바랍니다. 그리고 DCFH-DA 실험의 경우는 control군을 100%로 보정후 스트레스 처리후 증가 및 샘플 처리로 인한 감소를 보는것이기에 어떤 값을 빼거나 그러지 않습니다.
2) DCF-DA 용액을 세포에 처리하면 용액이 녹색으로 되는 것이 정상인가요?
용액이 녹색으로 변하는 경우는 DCF-DA가 산화적 스트레스로 인해 DCFH-DA로 변화하는 현상인거 같습니다. 본 실험에 있어서 배지 제거 후 washing 처리를 제대로 하지 않아 잔존하는 과산화수소로 인해 변화된 현상이 아닌가 싶습니다. 즉 DCF-DA가 세포 안에서 반응하여 DCFH-DA가 생성되는것이 아닌 세포 밖에 있는 다른 요소에 의해 녹색으로 변한거라고 판단됩니다.
3) DCF-DA 용액이 세포가 없는 well 에 처리하더라도 37도에서 incubation 시키면 녹색으로 변하나요? 처리 전의 용액은 무색이었습니다.
2번 경우와 동일한 현상이라고 보실수 있습니다.
정리하자면, 스트레스 처리가 매우 높아 세포가 죽어 상대적으로 값이 적게 나온 현상이라고 판단되며, 스트레스 처리를 좀더 낮은 농도에서 처리하면 control군 보다 더 높은 값이 나올것으로 예상됩니다. 혹시나 세포 독성을 보고 싶은 경우는 MTT나 WST로 확인해 보시는것이 좋을꺼 같습니다.
그리고 간단한 프로토콜을 말씀드리자면, seeding->sample 처리-> 2~3회 washing 후 DCF-DA 처리(HBSS 희석한거) -> 2~3회 washing 후 H2O2 처리(HBSS로 희석)-> 이 상태에서 별다른 처리 없이 바로 측정
도움이 되셨으면 좋겠습니다.^^
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레벨1
스탠
(대학원생)
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17.11.11 19:34
질문자입니다.
감사합니다~말씀하신대로 실험 진행중입니다. 결과가 나오면 알려드릴게요
아 그런데, 3번 질문은 세포도 없고 그냥 빈 well 에가 DCF-DA 를 처리했다는 이야기였습니다 ㅎㅎ (세포 및 세포에 가해진 H2O2 의 영향을 제외하고, DCF-DA가 그냥 혼자 변색되는지를 알아보려구요). 그래서 결과적으로 결과에서 보듯 변색이 됐구요... 그래서 실험실 내에서 discussion 했을 때는 DCF-DA 용액이 오래되어서 활성이 변했을 수 있다고 이야기가 나왔었어요. 확실하게 해보려고 24 well 에서 동일한 과정으로 이미지를 찍어보는 방법도 생각해봤었습니다.
일단 제 방법과 선생님께서 말씀해주신 방법으로 다시 진행해보는 중입니다. 감사합니다!!