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제가 볼 때는 dna degradation이 문제가 아닌것으로 보입니다.
지노 타입핑을 할 때에 DNA추출에는 크게 2가지가 있습니다. (개인적인 기준입니다.)
1. 키트를 이용한 추출법
2. 매뉴얼 추출법
글쓴이는 1의 방법을 사용하시는 것으로 보입니다. 그렇다면 키트 구성품중에 protein kinase K inhibitor가 포함되어 있는지 확인할 필요가 있습니다. 그리고 PCR에 사용하기 전에 이것을 inactivation 시켰는지도 확인해야 합니다. 이것이 PCR product (band)가 나오는 것을 방해합니다.
제가 주로 쓰는 방법은 2번입니다. 그냥 꼬리를 NaOH, EDTA에 넣고 끓는 물에 넣고 30분 끓입니다. 그러면 Protein kinase K는 그대로 죽어버리기 때문에 인히비터가 필요가 없죠. 무엇보다 빠르고 간단합니다. 끓이고 나서는 Tris 버퍼로 중성화 시켜서 보텍싱하고 그대로 template에 사용하죠.
글쓴이는 체크해야할 것은 일단...
프라이머의 상태, Tm온도(값), 키트 구성에서 protein kinase K inhibitor을 염두에 두고 실험했는지 여부, 사이클 횟수의 증가 등이 있겠네요.
파이페팃으로 dna degradation이 일어난다는 말은 생전 처음 들어봐서 잘 모르겠습니다.
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레벨1
스륵
(대학생)
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17.11.10 17:33
사용중인 kit에는 inhibitor가 없는것으로 보입니다. 사용중인 kit는 protein kinase k를 넣고 조직을 분해시킨뒤에 얼음에 박아 인히비션시키는 것으로 보입니다.
프라이머의 상태, Tm온도(값), 사이클 횟수의 증가 등의 조건들은 오랫동안 셋팅되어있던 것이라 제 손이 문제인것같고 말씀하신대로 protein kinase k가 PCR product의 생성을 방해한다고 생각하고 인히비션시간을 증가시켜보겠습니다.
파이펫팅에 의한 DNA degradation은 학부실험때 지나가며 들은 말이라 오류가 있을 수있을것 같습니다.
답변 감사합니다.