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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 genotyping시 DNA degradation에 관하여 질문드립니다.
알스륵(대학생)  | 2017.11.02 22:10
 안녕하세요. 현재 학부생으로 대학원 입학을 위해 실험을 배우고 있습니다.
mouse tail에서 kit를 사용해서 genotyping을 하고 있는데요.
purity 측정결과 대부분 260/280 1.7~2.0 사이에 들어오고 한, 두개 정도가 2.0을 넘는 상황입니다.
gel에 내린 결과 밴드가 뜨지않고 스미어하게 나타납니다. ladder는 정상적으로 보이구요.

질문드리고 싶은건
1. 추출시 dna degradation되는 경우가 혈액이 섞일 경우, 온도, 너무 강한 pipeting정도로 알고 있는데 추가적인 원인이 있을까요?
2. purity 측정 결과가 1.7~1.9사이로 나왔더라도 dna degradation가능성이 충분할까요?
(dna degradation에 의해서 제작된 primer가 붙을 sequence가 없어서 증폭이 안된건아닐까 생각해봤습니다.)

답변 부탁드립니다.
#DNA
 
#degradation
 
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리절대교주  |  2017.11.03   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
제가 볼 때는 dna degradation이 문제가 아닌것으로 보입니다.
지노 타입핑을 할 때에 DNA추출에는 크게 2가지가 있습니다. (개인적인 기준입니다.)
1. 키트를 이용한 추출법
2. 매뉴얼 추출법

글쓴이는 1의 방법을 사용하시는 것으로 보입니다. 그렇다면 키트 구성품중에 protein kinase K inhibitor가 포함되어 있는지 확인할 필요가 있습니다. 그리고 PCR에 사용하기 전에 이것을 inactivation 시켰는지도 확인해야 합니다. 이것이 PCR product (band)가 나오는 것을 방해합니다.

제가 주로 쓰는 방법은 2번입니다. 그냥 꼬리를 NaOH, EDTA에 넣고 끓는 물에 넣고 30분 끓입니다. 그러면 Protein kinase K는 그대로 죽어버리기 때문에 인히비터가 필요가 없죠. 무엇보다 빠르고 간단합니다. 끓이고 나서는 Tris 버퍼로 중성화 시켜서 보텍싱하고 그대로 template에 사용하죠.

글쓴이는 체크해야할 것은 일단...
프라이머의 상태, Tm온도(값), 키트 구성에서 protein kinase K inhibitor을 염두에 두고 실험했는지 여부, 사이클 횟수의 증가 등이 있겠네요.

파이페팃으로 dna degradation이 일어난다는 말은 생전 처음 들어봐서 잘 모르겠습니다.
알스륵  |  2017.11.10   

사용중인 kit에는 inhibitor가 없는것으로 보입니다. 사용중인 kit는 protein kinase k를 넣고 조직을 분해시킨뒤에 얼음에 박아 인히비션시키는 것으로 보입니다.
프라이머의 상태, Tm온도(값), 사이클 횟수의 증가 등의 조건들은 오랫동안 셋팅되어있던 것이라 제 손이 문제인것같고 말씀하신대로 protein kinase k가 PCR product의 생성을 방해한다고 생각하고 인히비션시간을 증가시켜보겠습니다.
파이펫팅에 의한 DNA degradation은 학부실험때 지나가며 들은 말이라 오류가 있을 수있을것 같습니다.
답변 감사합니다.

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