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레벨5
Daegu*
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17.10.09 16:04
1. 저는 protein isolation이랑 RNA extraction을 같이 하지 않습니다. 밑에 쓰신 글 처럼 반으로 나누어서 해도 되나, 그러면 얻게 되는 단백질의 양이나 RNA의 양이 너무 적을 확률이 높을 것 같네요, 차라리 100파이 디쉬를 한번더 계대를 하여 2개로 다시 나눈 다음 각각 확인 해 보세요.
2. RNA extraction 시에 주의 할 점은 chlroform 처리 후 centrifugation 한 다음에 상등액을 취할 때 아래층이 혼합되지 않도록 하는 거랑, 맨 마직 ethanol washing 과정에서 잔여 ethanol을 완전히 tube에서 제거 하는 것, 그리고 RNA pellet을 녹일 때 pellet의 색을 유심히 보셔야 합니다. RNA가 dry되기 전에는 육안으로 관찰 가능하며, dry 되기 시작하면 점차 투명해 집니다. 이때 투명해지자 마자 DEPC water 혹은 RNase free water, 혹은 TE buffer에 빠르게 녹이셔야 합니다.
3. 그렇게 하셔도 되나 저라면 70%의 세포를 반으로 한번 더 계대 한 후 키워서 각각 실험하겠습니다. protein extraction 시에 trypsin을 저는 사용하지 않습니다만,, 일부 실험실에서는 사용하기도 하더군요, membrane protein을 보는 경우나 extracellular anchored protein을 보신다면 그 방법은 추천하지 않습니다. 차라리 그렇게 진행 하실 거면 PBS있는 상태로 스크래퍼로 모으신 다음에 그걸 resuspension 하여 반으로 나누세요.
4. colony는 육안으로 뚜렷하게 보여야 합니다. 그 이전에 colony를 picking 하게 되면 잘 살아남지 못하며 건강하지 못합니다. 육안으로 보일 정도면 현미경으로 보았을 때에는 화면에 거의 꽉찰 정도 혹은 70~80% 찼는 경우입니다 (하나의 colony가)
파이펫 팁으로 picking 하는 방법은(옐로우 팁 사용) tip 끝부분 (파이펫이 맞닿는 부분)을 자른 다음 그리스를 아래 쪽을 쭉 둘러서 발라줍니다. 그리고 이것을 60파이 디쉬에 10개 정도 만들어서 올려 둔 후 (물론 그리스 역시 멸균 된 상태여야 합니다)
100파이 디쉬(콜로니가 자란)에 미리 콜로니를 picking 할 것을 아래 부분에 동그랗게 네임펜으로 표시를 미리 해두어야 합니다.
100파이 디쉬를 벤치로 가지고 온 후 미디어를 제거 해 주고(이후 과정 부터는 재빠르게 진행 해야 합니다) 표시 된 부위에 미리 만들어둔 그리스 발린 파이펫 팁을 하나씩 올려 주고 포셉 뒷 부분으로 바닥에 꽉 밀착되도록 꾹 한번 씩 눌러주세요. 그 후 팁안에 미디어 100ul씩 분 주 후 재빨리 파이펫팅을 10~15회 가량 조심스럽게 해준 뒤 12 well 혹은 24well로 옮겨 주시면 됩니다.
다시 한번 강조하지만, 콜로니는 육안으로 보여야합니다. 중요합니다. 현미경상으로 겨우 보일 정도면 콜로니라 할 수 없습니다.
5. primer design은 실험 목적에 따라 달라집니다. 어떤 pcr을 하실 건지를 말씀해 주세요, 일반적으로 cloning 용 pcr, mutagenesis, RT-PCR, qRT-PCR 등의 primer가 존재하며,
이들 실험에서도 각각 primer design할 시에 여러가지 고려하거나 조절해야 될 점이 분명히 존재합니다.
전 각각의 primer를 manual로 제작하기도 하지만, 각각 program 혹은 web에서 제작해주는 것을 사용하는곳이 있습니다.
1. 저도 몇번 해봤는데 썩 추천하고 싶지 않은 방법입니다. 기본 원리는 Trizol에 의해 denature된 단백질들을 회수하여 acetone 등의 유기용매로 precipitate시키는 것인데, 이렇게 침전된 단백질 pellet은 다시 녹이기가 쉽지 않을 뿐더러, 녹인다 해도 sample buffer 등 강한 ionic detergent를 필요로 하기 때문에 정량에 있어 어려움이 있습니다.
2. RNA extraction은 저온에서 빠르게 진행하는 것이 원칙입니다. 흔한 RNase의 source는 크게 두 가지가 있는데, 첫째는 실험자의 타액 (땀, 침, etc)이고 둘째는 세포가 가지고 있는 endogenous RNase입니다. RNA extraction 시에는 반드시 glove를 끼고 하시는 것을 추천드리는데, 이는 RNase contamination 방지 뿐만 아니라 Trizol 등 hazardous material로부터 실험자를 보호하기 위한 것도 있습니다. Tip이나 tube는 따로 autoclave할 필요가 없습니다.
3. 먼저 말씀드리고 싶은 것은, RNA만 뽑을 경우엔 PBS washing이 필요하지 않습니다. 그냥 media 걷어내고 바로 Trizol을 처리하면 됩니다. RNA와 protein을 동시에 prep하기 위해서는 PBS washing 후 PBS 1 ml 정도를 뿌리고 scrape한 후, 그 suspension을 두개의 tube로 나누어 담고 spin하여 하나는 RNA, 하나는 단백질 분석에 사용하면 됩니다. Trypsin 사용은 저도 같은 이유로 꺼리고 있습니다.
4. Colony가 육안으로 보이기 시작하면 따도 됩니다. 잘 자라는 세포라면 굳이 96-well에서부터 시작할 필요는 없고, 저같은 경우엔 24-well에서 expansion을 시작하기도 합니다. 제가 사용하는 colony picking 방법은 다음과 같습니다. 먼저 3MM paper를 작게 조각내 (대충 3mmx3mm?) 멸균합니다. 그리고 핀셋과 75% ethanol, trypsin을 준비합니다. 대충 작은 dish (35-mm?)에 trypsin 1 ml 정도를 뿌리고 거기에 멸균된 3MM paper들을 soak합니다. Colony가 뜬 dish에서 colony 위치를 네임펜으로 마킹합니다. Media를 걷어내고 PBS로 한 번 washing을 해줍니다. 마킹된 colony 위에 trypsin으로 적셔진 3MM paper 조각을 하나씩 올려놓고 1~3 min 기다립니다. 이 때, dish가 마르지 않도록 빠르게 진행해야 합니다. 그리고 그 paper 조각들을 96-well (or 48-well or 24-well) plate의 well당 하나씩 집어넣고 흔들어 줍니다.
5. Bioneer 홈페이지에 가시면 query sequence 집어넣으면 oligo 자동으로 design해주는 웹서버가 있던데 그거 괜찮더군요.
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레벨3
cell40
(과기인)
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17.10.10 14:51
Daegu*님, 자세한 답변 정말 감사드립니다.
답변을 바탕으로 cell을 좀 더 키워서 계대한 후 각각 assay를 해보기로 했습니다.
어제 연습삼아 했던 RNA extraction은 pellet을 빨아들일까봐 겁이 나서 ethanol을 꽤 남겼었는데
그것 때문인지 purity, 농도가 만족스럽지 않았습니다 (오늘 확인).
말씀주신대로 ethanol을 완전히 제거하고 pellet을 관찰하면서 빠르게 녹였더니
오늘 결과는 잘 나왔습니다. 진심으로 감사드립니다.
Colony picking 방법 자세히 알려주셔서 큰 도움이 되었습니다.
오늘 오후에 준비해서 많이 증식해있는 정상 세포주에서 연습해 볼려고 합니다.
Primer는 qPCR을 위한 primer를 말씀드린 것이었습니다.
PCR도 곧 할려고 하니 긴장되네요 ^^;;
다시 한번 답변 감사드립니다. 즐거운 오후 되십시오!
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레벨3
cell40
(과기인)
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17.10.10 15:12
Lucid님, 답변 진심으로 감사드립니다.
오늘 RNA extraction 하면서 글러브, 마스크도 끼고 했습니다 ^^;;
랩에 혼자 뿐이라 입을 열 일은 없지만 ㅠㅠ 그래도 혹시나 해서요.
어제보다 나름 좀 더 철저하게 하고 속도도 붙어서인지 결과가 좀 더 잘 나왔습니다.
Colony picking 방법 자세히 알려주셔서 정말 감사합니다.
오늘 오후에 이 방법으로도 연습해 볼려고 autoclave 등 준비를 해놓은 상태입니다.
연습하면서 제가 가장 잘 할 수 있는 방법을 찾아야겠지요...
웹사이트 정보도 정말 감사드립니다.
항상 친절하게 답변 주시는 선생님들 덕분에
한달 반 전 세포가 뭔지 media가 뭔지도 모르는 상태로 실험실에 발을 들인 제가
그나마 실험실 생활을 하고 있는 것 같습니다.
남은 하루 즐겁게 보내시기를 바랍니다. 감사합니다!