다른 것보다 1번 항목이 눈에 밟히네요.. 20만개의 세포를 96well 중에 1 well에 넣는다는게
맞나요? 이 정도면 cell 들이 제대로 자라는 상황이 아니라서 무슨 약물을 치든 원하시는 결과를
얻기 힘들 겁니다.. 잘못 기재하신 건지 확인 부탁드려요..
본문의 형태를 볼 때, 20만개 세포가 1ml에 있다는 뜻 같고.. 1 well 당 160 ul씩 분주하니깐 대략
3.5만개 정도가 1 well에 들어가는데요.. 이거 진짜 많이 넣으시는 겁니다..
그리고, 실험의 목적마다 다르지만, 보통 제조사에서 권하는 방식으로 하는게 소모량은 많아도
가장 스탠다드에 가깝습니다.. 안되면 그 때 변경하시는 걸 추천드리고요..
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레벨1
으아
(과기인)
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17.10.08 15:52
그리고, 실험의 목적마다 다르지만, 보통 제조사에서 권하는 방식으로 하는게 소모량은 많아도
가장 스탠다드에 가깝습니다.. 안되면 그 때 변경하시는 걸 추천드리고요..
답변주셔서 감사해요ㅠ
제가 24.0*10^6 cells/ml 이 나와서 2*10^5 cells/200ul->1.0*10^6 cells/1ml 이렇게 계산해서 24배 희석을 해서 깔아줬거든요ㅠ 이렇게 깔아준 cell은 NO가 생성돼서 반응(Blank빼고 다들 색변화가 있었습니다 Blank는 노란색으로 흡광 0.05~0.06정도 나왔습니다.)했는데,
여기서 2배 더 희석해서 깔아준 96well에는 NO 생성이 되지 않았습니다ㅠ
그래서 20만개로 잡고 있었는데 크게 문제가 될까요?ㅠ
제 분야가 아니라서, NO assay나 LPS 트릿 정도는 해보았지만 나머지는 정보도 없고 좀 어려워서... 특히 PSAW는 무슨 뜻인지 전혀 모르겠습니다 (구글링 해보면 multiplate reader기 같기도 하고....)
만약에 정말로 20만개 까셨다면 제가 느끼기엔 이렇습니다..
10만개 깔았을 땐 안 나오던게 20만개 깔았을 때 나오는거고.. 여기서 NO는 exo-에서 나오는게 아니라 secretion된다고 전 이해를 하고 있고요.. 세포가 자극을 받아서..
그렇다면 10만개 깔았을 땐 LPS에 의해서 세포가 다 죽어버린거고, 20만개 깔았을 땐 죽지 않은 세포들에 의해서 NO가 나온다 전 그렇게 생각됩니다..
보통 세포의 종류나 크기마다 면적 당 깔리는 양이 다르지만, 사용하신 세포가 cell line이라고 추측되고 이런 경우 면적 크기 관계 없이 multilayer로 세포가 자랄 수 있습니다.. contact inhibition등을 무시할 수 있어서... 제가 사용하는 96well plate 확인해보니, 31mm^2 의 넓이고, 제가 키우는 가장 작은 세포로 4-5만개 정도면 완전 100% confluent해지는 정도입니다.. 그렇다면 글쓴분이 20만개 깔았다면 최소 4-5개의 세포 두깨로 깔렸을거고.. 이런 경우엔 하층 세포가 죽지 않아서 NO을 secretion할 수도 있겠지요..
포닥 선생님이 처음에 seeding했던 세포숫자가 얼마인지요? 그것도 조금은 궁금하네요..
조금 더 자세히 적어주시면 좋겠습니다.. 특히 약어를 쓰시면 이게 찾아도 맞게 찾았는지 의문이 들 때가 많아서요..
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레벨1
으아
(과기인)
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17.10.09 00:33
아 계속 봐주셔서 감사해요ㅜ
죄송합니다 PSAW가 아니고 PASW라는 프로그램입니다.
저는 SPL에서 판매하는 96well plate 사용중입니다.
cell의 종류는 RAW cell입니다.
박사님말로는 본인은 보통 10만개 정도 깔아서 하신다고 했습니다.
그렇다면 예상되는 것 중 하나는 LPS의 농도가 높아서 10만개 깔았을 때 cell이 죽어서 그렇다고 볼 수 있는 건가요?
제가 현미경으로 관찰했을 때는 세포가 떠있거나 하지는 않았습니다ㅠ 제가 있는 실험실이 세포를 하는 실험실이 아니고 학부 때도 세포 실험을 해본 적이 없어 부착해서 크는 세포는 떠있으면 죽어있다고 생각하고 실험하고 있었습니다..
떠서 자라는 세포(suspension cell)이 아니라 부착해서 자라는 세포 (adherent cell)이라고 임의로 제가 가정하고 생각한다면 SPL 96 well plate의 면적은 0.32cm^2 입니다.. 35 pi culture plate는 대개의 경우 8.9-9.4cm^2의 크기를 가지고 있고, 여기에 일반적인 암세포 종류를 최대로 키운다면 100-120만개까지 들어갑니다.. monolayer로 자라는 것 기준으로.. primary cell같은 경우엔 8-9만개 정도 줄기세포는 그보다 작은 5-6만개 정도...
다시 본론으로 돌아가면, 암세포주를 사용하셨다고 가정한다면, 10만개/cm^2가 정상적으로 자랄 수 있는 최대치이고 96well plate에 깐다면, 3-4만개가 역시 최대치입니다. 실험에선 대개의 경우 80-90% 수준에서 실험을 끝내는 것을 권장하기 때문에 2-2.5만개 선에서 끝을 내야겠죠.. 그럼에도 불구하고 10만개를 까셨다면 해당 세포주가 굉장히 작아서 더 밀착될 수 있다거나 아니면... 다른 이유가 있어야 한다고 전 생각합니다..
그렇지 않다면 다층구조로 어거지로 세포가 밀집해서 자라는데 LPS의 전달이 세포두께 3-4겹까진 어떻게 어거지로 되는거고, 그 이상 20만개 깔아서 6-9겹이 되면 전달이 일부 안되고 스트레스만 받는 상황이라고 봐야겠죠..
stress induced NO는 다양한 종류의 자극 및 스트레스에 대해서 알려져있기 때문에요..
박사님이 바쁘시다고 안 가르쳐주는 건... 포닥이 사람 가르치라고 있는 건 아닐 수도 있긴 한데 좀 너무하시긴 하네요. 스스로 답을 찾으라는건가.. 보통 석사에게 스스로 답을 찾아서 가져오라고 하면 그 답이 맞는 경우가 드문데.. 교육의 목적으로 스스로 답을 찾으라고 해도 일정 시간이 지나면 답을 알려주든가 방향 제시를 해주든가 트러블 슛을 해주는게 맞는데.. ㅠㅠ
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지나가다
(비회원)
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17.10.09 03:54
내 친구 얘기 같아서 그냥 안 넘어가고 글 좀 씁니다.
96well에 10만~20만개를 깐다구요?
너무 많은 거 아닌가요?
cell마다 다르긴 하지만 96well 100% confluent일 경우에도 10만개 정도도 겨우 될 거 같은데
20만개를 seeding하고 다음날 실험을 한다?? 이거 근본적으로 seeding에 문제가 있는 거 같은데요
20만개를 깔고 다음날 cell을 보면 cell이 다 붙어있던가요?
제 생각에는 대부분은 붙지도 못하고 둥둥 뜰 거 같은데...
여튼 일단은 정리해보면...
1. cell을 정말로 1.0 x 10^5 을 깐 게 맞는 지 체크한다. (cell counting 제대로 하는지 확인한다.)
2. cell을 깔고 다음날 cell confluent를 체크한다. (붙지 못하고 떠 있는 cell도 어느정도인지 확인한다.)
3. 1번과 2번에 문제가 없다면 아무것도 treat하지 않은 cell에 LPS를 처리했을 때 나오는 값이 다른 사람들과 비슷한 지 체크한다. (일단 박사님이 측정한 raw data보고 control에서 흡광도 몇 나왔는 지 확인하세요. 글쓴이랑 다른지)
4. 3번까지 해결이 됐다면 drug가 제대로 working하는 게 맞는 지 체크한다. (L-뭐시기라고 적힌게 뭔지 잘 모르겠는데 일단 농도가 매우 낮네요. 그런 부분에서 handling에 실수 없는지 확인하고 현재 사용하는게 맛이 안 간건지 확인하세요. 최대한 신선한걸로 실험할 때 쓰시구요.)
그리고 griess reagent는 연구실에서 계속 해온 protocol을 따라하세요. 지금 문제가 자기만 실험 결과가 이상한 거니까요. 그리고...박사님이 얼마나 바쁜지는 모르겠지만...문제 잘 해결되길 바랄게요.
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질문할때에는
(비회원)
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17.10.09 04:02
L-NMMA 0.25μg/ml, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.015625, 0.0078125 의 농도로 하였는데.반복실험했는데 IC50이 0.3~0.4가 나왔습니다. sample들의 IC50도 0.6~2.5 사이로 나타났습니다..다른 선배들의 논문을 참고하여도 이렇게 좋은 값이 나오지는 않았습니다..
이 부분에서 IC50이 0.3~0.4가 나왔다고 했는데 단위 제대로 적어주세요
또 sample이 cell line을 의미하는 건가요? L-NMMA를 의미하는건가요?
설명 제대로 해주셔야 조금이라도 도움드리죠
답이 늦어서 죄송해요. 세 분 다 정말 감사합니다.
Cell은 RAW cell 사용 중이고 sample은 천연물 추출물을 sample로 이용중입니다.
질문님 IC50의 단위는 μg/ml입니다.
답변주신 것 들을 참고해서 이번에 실험 셋팅은
96well에 4*10^4cells/well 로 seeding하였습니다.(160μl)
[2*10^4cells/well로 하니까 빈곳이 많이 보여서 2배 높혔습니다.]
sample은 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.8125 μg/ml의 농도로 처리하였습니다.(20μl)
LPS의 농도는 1μg/ml의 농도로 설정했습니다.(20μl)
오늘 저녁에 결과가 나옵니다. 혹시 문제점이 보이면 피드백부탁드려요 감사해요.
sample 천연물 추출물 말고 positive control로 L-NMMA 도 사용하고 있습니다!
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FACS aria
(비회원)
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17.10.10 12:44
L-NMMA는 NO inhibitor입니다. 정확히 알고 싶은 실험이..
추출물이 NO의 발생을 증가시키는것인지?? 아니면 NO의 발생을 억제하는것인지요??
LPS로 stimulation하는것으로 봐서 증가된 NO를 추출물이 억제하는것이 아닌지 생각됩니다.
일단 제가 실험하는것은 standard로 NO2 혹은 NO3가 Griess에 의해 변화되는지 여부를 관찰하
구요.
또한 media에 색깔이 좌지우지 하기때문에 phenol red가 빠진 media를 사용합니다.
Griess는 ELISA 540nm 흡광도에서 측정합니다.
먼저 NO inhibior에 의해 잘 억제되는것 같은데 먼저 추출물을 농도별로 처리하시고
측정해보세요...
4*10^4cells/well로 seeding한 뒤 상등액 딴 뒤 현미경으로 관찰한 LPS만 처리한 Negative control 세포 모양입니다.
이것은 아무 것도 처리하지 않은 Blank 입니다.
RAW cell로 실험중이고..
천연물 추출물로 NO inhibition 얼마나 되는지 보는 실험 중입니다..
2*10^5cells/200μl 로 seeding하고 LPSμg/ml 로 처리하였을 때 반응이 일어났으며 처리한 농도에 따라 Inhibition 정도가 떨어지는 것도 확인하였습니다.(10만개로했을때는 반응이 일어나지 않았습니다.)
제가 문제가 되는 것은 저와 같은 나무 추출물로 같은 NO assay를 실험한 졸업하신 선배님들이나 다른 논문의 data에 비해 IC50의 값이 많이 낮은 편(낮으면 좋은 것이라 효과가 너무 좋게 나타났습니다)이라서 도움을 요청하고 있는 중입니다...
계속 답변 달아주셔서 감사합니다.
NO production에 영향을 주는 몇가지가 있습니다
첫째로, cell passage가 이전 실험들과 차이가 있을수도 있어요 Raw cell 염증반응이 생각보다 passage영향 많이 받아요
또, 반응시간 차이일수도 있습니다 NO는 LPS처리 후 보통 16h~24h 이후에 측정하는데 이것도 16h에 24h에 NO값이 다르게 나옵니다
그리고 글쓴님께서 약물 처리 했을때 다른분들보다 inhibition이 더 잘되는 경향을 보이셨다고 했는데
그럼 좋은거 아닌가요?ㅎㅎ 실험을 잘하신다는 말인것같네요
이전 선배들 논문만 참고하지 마시고 다른 논문들을 확인해보세요
NO inhibitor를 control로 거셨으니 다른 논문들에서 control의 값을 보시면 되겠네요
그 값이 글쓴님과 비슷하다면 맞게 실험하고 계시는 겁니다
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레벨1
킴텤도둑
(과기인)
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23.11.21 16:03
같은 문제를 겪고 있는 석사생입니다,, 혹시 어떻게 해결하셨는지 여쭤봐도 될까요?ㅠㅠ