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레벨5
Daegu*
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17.09.24 12:36
1. Transfection 하루 전날 6-well plate에 cell을 깔아놓고
그 다음날 DNA+transfection reagent cocktail을 well에 넣어주는 것으로 알고 있습니다.
이때 6-well plate에는 FBS가 없는 순수 media (예: DMEM)를 넣어줘야 되는
것으로 이해했는데, 맞는지요?
- serum이 있어도 되고 없어도 됩니다. 요즘 나오는 reagent는 크게 영향을 미치지 않습니다.
다만 transfection 17~24시간 사이에 media는 한번 갈아 주면 좋습니다.
-항생제는 크게 영향을 미칩니다. (P/S) 일부 세포는 배지에 항생제가 포함 되어 있으면 세포가 많이 죽어 나갑니다. 이런 경우 항생제를 빼 주면 해결 됩니다.
2. Cocktail을 well에 넣어주기 전에,
기존의 순수 media를 suction 해내고 opti-MEM으로 갈아주는 것이 좋을지요?
Opti-MEM을 쓰는 이유는 transfection에 영향을 미칠 수 있는 여러가지 요인을 제거하기
위함이라고 알고 있습니다. 그런 맥락에서 본다면 opti-MEM을 넣어주는 것이 나쁘지는
않을 것 같아서요.
- Opti-mem은 단지 내부 조성물에서 transfection에 영향을 주지 않을 만큼 조성물을 뺀 media일 뿐입니다. 안하셔도 됩니다. 그냥 FBS 포함 되거나 포함 되지 않은 media로 교체 해 주시거나 seeding 24시간 후 미디어 교체 없이 바로 하셔도 무방합니다.
3. 만약 굳이 opti-MEM을 안 넣어줘도 된다면, 전날 넣어놓은 순수 media에 cocktail만
추가하시는지요, 아니면 media는 suction 해내고 cocktail만 넣고 지켜보다가 6시간
정도 후 FBS 들어간 media를 넣어주시는지요 (이렇게 하는 경우도 있다고 봐서요...).
-전날 넣어 놓은 순수 미디어에 칵테일만 넣어도 되고, serum free media (세포 키울 때 쓰는 미디아)에 transfection 한 후 6시간 뒤 media를 FBS가 포함 된 걸로 바꾸기도 합니다.
어느방법을 쓰시던 무방합니다.
4. 프로토콜을 보면 6-well에서는 각 well 당,
opti-MEM 150 uL + 적정 lipofectamine (-> 10 uL를 쓸려고 합니다)
opti-MEM 150 uL + 적정 DNA (-> 4 ug을 쓸려고 합니다)
을 넣으라고 되어 있는데요.
Lipofectamine이나 DNA는 양에 따라 toxicity가 있을 수 있다고 봤습니다.
그렇다면 opti-MEM은 250 uL로 증량해서 넣어줘도 되는지요?
어떤 프로토콜에는 250으로 되어 있기도 해서 여쭤봅니다.
-제 경험상 6-well기준으로는 1ug이상의 DNA는 넣지 않습니다. 굉장히 toxic 합니다.
lipo 양도 4ul정도면 충분합니다.
- opti-MeM은 125x2로 해서 2개의 tube를 만든 후 1개의 tube에는 DNA를, 다른 하나에는 lipofectamin을 넣고 두개를 혼합하여 incubation 한 뒤 세포에 넣어 주시면 됩니다.
5. 4.의
opti+lipo,
opti+DNA를 섞은 후 5분간 incubation 하고 well에 넣어주라고 되어 있는데,
이전 버전 프로토콜이나 bric 글들을 읽어보면
opti+lipo를 만들어서 우선 5분간 RT에서 incubation 하고
이후
opti+lipo와
opti+DNA를 섞어서 20분간 RT에서
다시 incubation 한 후
well에다가 넣어주라고 되어 있습니다.
이 차이에 대한 이유를 찾지 못했는데요 ㅠㅠ 어떤 방법을 써야 할지 궁금합니다.
6. 위의 과정 이후에 8시간 후 관찰해서 toxicity가 없으면
transfection으로부터 24시간째 FBS가 있는 media로 갈아주고,
transfection으로부터 48시간째 100파이 dish로 옮긴 후
selection 위한 antibiotics를 처리해줄 예정입니다.
그 이후 antibiotics containing media를 2-3일마다 교체하면서 관찰하다가
적정 시간 후 colony를 따서 96-well부터 시작하여 큰 size dish로 옮기면서
stable cell line을 얻을려고 합니다.
적정 시점 (6 cm dish로 옮길 때쯤) western blot을 해볼려고 합니다.
- 8시간 이후에 교체 해줄 필요가 없습니다. serum free 조건에서 하신거라면 media를 FBS가 들어간 것으로 교체 해 주시거나 첨가해 주시면 됩니다.
나머지는 그대로 하시면 됩니다.
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레벨3
cell40
(과기인)
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17.09.25 15:41
Daegu*님, 답변 정말 감사드립니다.
자세한 답변 덕분에 오늘 6-well plating을 하고 24시간 후 transfection을 할려고 합니다.
오늘 넣어준 media (serum 있음, antibiotics 없음)는 그대로 두고 transfection cocktail만 추가한 후,
cocktail 추가로부터 17-24시간 사이에 media를 교체할 예정입니다.
조언 정말 감사드립니다.
그리고 DNA 양과 lipo 양에 대해서 한번 더 여쭙고 싶습니다.
제가 6-well 기준으로 4 ug, 10 uL를 잡은 이유는 제가 봤던 프로토콜 때문인데요.
혹시 시간 되시면 아래의 프로토콜 중 4페이지 확인 부탁드립니다.
http://people.ds.cam.ac.uk/yhbl2/files/protocols/lipofectamine2000.pdf
여기에는 6-well 기준으로 4 ug, 10 uL로 나와있어서요.
하지만 DNA, lipo가 toxic 할 수 있다는 글을 많이 봐서 일부러 용량을 적어서 여쭤봤었고
경험과 지식을 공유해주셔서 정말 감사합니다.
그런데 이 프로토콜은 이렇게 높은 (?) 용량을 잡았는지 좀 궁금합니다. 회사 (invitrogen) 프로토콜 같은데요~
자세한 답변 다시 한번 감사드립니다. 꾸벅~
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lentivirus
(비회원)
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17.09.26 04:51
lipofectamine으로 인한 transfection은 셀라인에 따라 독성정도가 틀립니다.
어느 셀라인은 8시간이상두면 그대로 다죽어버린다던지
어떤 셀라인은 그 이상둬도 멀쩡합니다.
저는 6well 경우
Tube1 ) lipofectamine3000 7.5ul+OptiMEM 250ul
Tube 2) DNA ~2.5ug+OptiMEM 250ul+P3000 5ul
Mix 후 RT에서 20-30min 둡니다만...
Transfection time은 cell line에 따라 2-4hrs or O/N
처음 해보는 cell line에서 잘 안되면 이것저것 바꿔봅니다.
Lipofectime과DNA의 량 or Transfection time
결국 자신이 쓰는 셀라인에 맞춰서
여러 번 실험해보시면서
최적의 protocol을 정립해나가야 합니다.
5. 의 경우
lipofectamine이랑 dna이 complex 를 형성하는데요.
당연히 complex 형성까지 충분히 시간을 주시는게 낫습니다.
저도 5분으로도 충분해보이기는 한데... 급한 경우 아니면 다들 20-30분 정돈 두더라구요.
자세히 보진 않았으나 아마 메뉴얼에 적힌 것은 cell line을 고려하지 않은 것으로 보여지고, 경험적으로 봤을 때 DNA와 reagent의 비율은 리포2000 메뉴얼에 적혀있는것이 일반적인 cell line에 비해 전체적으로 높아보입니다. 딱 한 단계씩 낮춰서 보시면 될 것 같아요.
저희 실험실 같은 경우 6-well의 경우 1~2ug, 60pi는 최대 4ug, 100pi의 경우 8ug 정도로 DNA를 사용하며(HEK293이나 Hela cell과 같은 일반적으로 많이 사용하는 cell line 기준) reagent도 그에 맞춰서 사용하는 편입니다. 그 이상의 DNA는 toxic해서 cell death가 일어나구요. 리포펙타민의 경우 reagent자체가 toxic하기 때문에 media change를 해주는 것도 중요합니다.
좋은 결과 있길 바라요~
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레벨3
cell40
(과기인)
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17.09.27 11:16
lentivirus님, 답변 정말 감사드립니다.
저도 여러 선생님들의 답변 고려해서 DNA 2 ug, lipofectamine 6 uL로 해봤습니다.
Optimization 과정이 당연히 필요하고 오래 걸릴 수 있다는 것을 머리로는 아는데
혼자서 하는데다 위에서 자꾸만 압박을 받다보니ㅠㅠ
조바심도 생기고 너무 세세한 것까지 자꾸 여쭤보게 되네요.
아 incubation 시간이 complex를 형성하는 시간이군요.
저도 10분 두었는데 실험이 서툴러서 실제 incubation 시간은 거의 20분쯤 되지 않았을까 싶습니다.
허둥대느라...;;;
아무튼 tranfection 하고 GFP를 봤는데 아주 high efficiency는 아니어도 보이더라고요.
거의 감동의 눈물 흘릴 뻔 했습니다 ^^;;
답변 다시 한번 감사드립니다.
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레벨3
cell40
(과기인)
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17.09.27 11:22
aa님, 답변 정말 감사드립니다.
저도 선생님들의 답변, 구글 검색 등을 보면서 머리를 쥐어뜯다가
결국 well 당 2 ug로 하긴 했습니다 ^^;;
프로토콜도 중요하지만 경험이 정말 중요한데
혼자 일하는 와중에 브릭에서 많은 도움을 주셔서 얼마나 감사한지 모릅니다.
위에도 썼지만 GFP green이 보이는 걸 보고 눈물 흘릴 뻔 했습니다 ^^;;
그러다가 media를 잘못 넣을 뻔 했지만...;;;
(media가 각기 다른 cell line 3가지를 한꺼번에 하고 있어서요)
다시 한번 감사드리고 오늘도 즐거운 하루 되십시오.