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레벨6
Baltimore
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08.06.12 13:04
답변 1.
일반적으로 모든 유전자에는 CDS라고 하여 Gene bank에 보시면 그 시작과 끝의 위치가 나옵니다 다시 잘 보세요 (ex CDS 314... 1099)
예를들어 A gene의 mRNA크기가 1500bp이고 CDS가 위와 같을경우 1500bp중에서 314번째에서 실질적인 유전자가 코딩을 시작하여 1099번째에서 끝이난다는 것입니다
잘 보시면 314번째에서 ATG의 A나 나오기 시작하고 1099번째에서 TGA라 한다면 A가 나오게 됩니다
회사측에서는 그런것을 물어보는듯 하네요
답변 2.
Start와 stop codon이 없다면 vector에 넣어도 그것은 empty vector입니다
다시말해서 아무것도 발현되지 않는 비어있는 vector라는 뜻입니다
vector는 replication origin이 있어서 자체적으로 합성을 시작하겟지만 MCS에 다다라서 실질적인 insert 의 유전자를 발현시키게 되어있습니다
즉 다시말해서 insert의 유전자에 start codon이 없다면 vector는 아무것도 읽지 못하여 자기 자신만을 합성하는 것이지요 그렇다면 이것은 빈 vector인 것입니다
무슨말인지 이해가시죠??
답변 3.
codon은 따로 합성안하셔도 됩니다 Gene bank에서 잘 찾아보세요 발현되는 mRNA라 한다면 반드시 start, stop codon이 있어야 합니다
codon seq.만 함성하여 ligation한다는 것은 정말 힘든 일일듯 합니다 ;;
1. 회사에서 요구한 것은 질문자가 가지고 있는 DNA 내에 start, stop codon이 다 들어있느냐, 즉 CDS를 모두 포함하고 있느냐 여부를 물어본 것이지 DNA의 맨 앞에 start, 맨 뒤에 stop codon이 있어야 한다고 요구하지는 않았으리라 봅니다. 질문자의 오해인듯..
2.자체의 promoter가 있으니 transcription은 되겠지만 mRNA에 start codon이 없으면 translation은 안되겠죠? 이건 질문자가 잘못생각하고 계신거고..
3. 가지고 있는 DNA가 full length cDNA이거나 CDS를 모두 포함하고 있으면 그런 일은 할 필요가 없습니다만, 혹시 partial cDNA라면 문제가 좀 다르지요. 발현시키기 위해 최소한 5''에 in frame으로 ATG를 넣어주셔야 합니다. 이거야 PCR한번 돌리면 되니 그닥 어려운 일은 아니지요.
Baltimore님, 아라곤님, 이렇게 금방 설명하여 주셔서
정말 감사드립니다.
그런데, 아라곤님께 다시 질문이 있습니다.
"5'' in frame으로 ATG를 넣어 줘야 하고 PCR 돌리면 된다"고 하셨는데요,
질문: 그럼 특별한 프라이머를 제작하지 않고
그냥 제 gene에 대한 프라이머로 피씨알을 돌리면 ATG가 저절로 생기나요??
일반적으로 Taq으로 PCR하면 product에 "A"가 생기는 것은 알겠는데
말씀하신 부분이 잘 이해가 가지를 않아서 여쭤봅니다.
(너무 무식하게 질문드리는 거 같아서*^^* 죄송합니다.)
좋은하루되시고 시간되실때 요 질문에도 답변 부탁드립니다. 고맙습니다. 꾸벅~
가지고 있는 DNA가 partial cDNA입니까?
그런 경우에는 당연히 ATG-XXX-XXX-XXX 이런식으로 in frame ATG를 포함하는 이루어진 primer를 따로 만들어서 다시 PCR하셔야 합니다.
클로닝을 해본적이 없다고 하시니 글로는 설명하기가 힘들군요.
그쪽 업체에다가 pShuttle vector에다가 옮길때 in frame ATG를 첨가해서 만들어달라고 하시면 될듯합니다. 어짜피 자기네 vector로 옮길 때도 PCR로 restriction enzyme site를 붙일테니까요.