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질문 PCR product의 degradation
알쏭이  | 2008.06.06 16:50
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: PCR product.JPG (128 KB)
이미지 첨부파일
cloning을 하려고 PCR 하였습니다.
PCR product의 size는 2.8kb 정도 되구요.
첨부 파일을 보시면 아시겠지만 PCR은 무척 잘 됩니다.
이것을 enzyme(Xba1)으로 cut한 뒤에 elution만 하면 degradation되는 것 같습니다.
왜 이런 걸까요?
왼쪽이 elution전 PCR product이고 오른쪽이 elution후 PCR product입니다.
elution할때에도 agarose gel을 자르기 전에 UV를 쬐어보면 band가 깨어지지 않고 one band로 보입니다. 근데 elution만 마치면 저렇게 degradation되어버립니다.
그래서 agarose gel에 내리지 않고 그냥 PCR product(solution 상태)에 QG buffer를 섞어서 elution을 해보았는데도 저렇게 degradation이 되어버립니다.
한번도 이런일이 없었는데 정말 답답합니다.
왜이런 걸까요?
#PCR product degradation
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
Lin  |  2008.06.07    
did you happen to check if your elution buffer or water is contaminated?
알쏭이  |  2008.06.08    
elution buffer는 항상 DDW를 사용하구요.
계속이러니까 시약을 모두 바꿔봤는데 하다못해서 autoclaved DDW를 0.22um syringe filter까지 했어요. ㅠ
올챙이wook  |  2008.06.09   
답답하시겠어요.
Gel extraction kit의 문제를 확인하려면 옆 방에서 다른 kit를 얻어서 실험해
보시면 될 것같습니다.

하지만 우선은 실험의 진행이 더 중요하죠? (사실 이런 것에 발목이 잡히면 화가
나지요..)
PCR 밴드를 보니 one band로 아주 깨끗히 잘 된 것같습니다.
혹시 PCR purification kit가 있으시나요?
그럼 그것을 사용하시고 없으시면 Ethanol precipitaion을 하셔서 실험을 진행
하세요.
밴드가 여러개 나오는 것도 아니니 꼭 gel에 걸어서 elution하실 필요는 없습니다.
대왕개구리엘피스  |  2008.06.09   
결과를 보니 pH가 너무 높아 DNA가 hydrolysis되는 현상과 유사합니다. Kit의 문제일 거란 생각이 듭니다만..... 다른 kit를 사용해 보세요.
개구리코스모진텍  |  2008.06.09   
PCR product를 보면 강한 원밴드에 non-specific한 밴드(윗부분)가 보입니다.

혹, pcr product를 얻기 위해 사용하신 template가 뭐였는 궁금하네요.

혹 남은 template에 enzyme site가 있다면 이런 현상이 있을 수 있습니다.

정확한 판단을 위해서 enzyme 처리를 하신 후, gel extraction을 하지 마시고

전기영동으로 확인을 해 보시면 문제점을 찾을 수 있으리라 생각됩니다.

agarose gel에 내리지 않고 그냥 하셨다고 하셨는데, 이렇게 해도 결코

문제가 되는 부분이 없으니 안심하셔도 될 것 입니다.

물론 yield에 미세한 차이점(size에 따른 차이점)은 있습니다.

자세한 설명 혹은 gel extraction 샘플이 필요하시면 연락부탁드립니다.

연구개발부 protein expression team.
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