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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 qRT-PCR 결과가 제대로 나오지 않습니다.
알(과기인)  | 2017.06.16 15:55
  
안녕하세요. 이제 막 PCR 을 시작한 초보 실험인입니다.
다름이 아니라 qRT-PCR에 대해 궁금한 점이 있어 글 남깁니다.

qRT-PCR로 target gene의 발현 정도를 확인하는 실험을 진행 중인데 그 과정에서 결과가 잘 나오지 않아 고민입니다.

cell로부터 수확한 RNA로 cDNA를 합성한 뒤 SYBR Green(TaKaRa 제품) 이용해서 Real Time PCR을 수행하고 있는데, 제대로 증폭이 되지 않습니다. 처음에 HUVEC cell로 실험하다가 증폭이 되지 않아 Raw 264.7 cell로 바꾸어 진행했는데 마찬가지로 제대로 증폭이 되지 않네요. 일반 PCR 진행한 후 전기영동하여 확인하면 밴드가 잘 확인이 되는데, qRT-PCR로는 확인이 되지 않아 고민이 많습니다.

시약이나 프로토콜, 기계에 문제가 있나 싶어 마우스로부터 뽑아낸 cell 이용해서 동일한 실험을 진행했는데 이 경우에는 문제없이 qRT-PCR 결과가 나옵니다. 시약, 기계 전부 문제 없는 것을 확인했고, Raw cell에 사용한 primer의 경우 동일한 primer 사용했을 때 마우스로부터 얻어낸 cell에서는 제대로 qRT-PCR 결과가 나오는 것을 확인했습니다.

여러가지 찾아보았지만 도대체 왜 HUVEC cell과 Raw 264.7 cell의 경우는 제대로 결과가 나오지 않는지 알 수가 없네요. 혹시 이에 대해 아시는 바가 있으시다면 답변해주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ




#qRT-PCR
 
#Raw264.7
 
#HUVEC
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리절대교주  |  2017.06.16   
HUVEC cell (https://www.atcc.org/products/all/CRL-1730.aspx)
=> Human cell

Raw 264.7 cell (https://www.atcc.org/products/all/TIB-71.aspx)
=> Mouse cell

일단 프라이머가 세포에서 발현되는 유전자를 정확히 잡는지 NCBI에서 확인해 보시구요
(프라이머 시퀀스를 blast 돌려보세요)

cDNA의 양이 상대적으로 매~우 적어서 그럴 수도 있는데 리얼타임할 때 사이클 수 몇으로 하시나요?

안나오면 55사이클을 돌려야 할 때도 있어요.

쓰레스홀드라고 그것도 분석시 봐줘야 할 때가 있는데...

흐음.... 정확히 프로토콜을 어떻게 하셨는지 모르니 일단 이정도 예상됩니다.
올챙이HydroAssoc  |  2017.06.17   
1. Taqman primer와 sybr green master mix는 서로 검출 못함
2. Mouse transcript 를 기본으로 설계된 마우스 프라이머를 류먼쎌 RNA 에 쓰면 검출불가
3. 밴드로 확인할 때 쓴 semi quantitative rt pcr의 master mix 는 무엇인지?
 |  2017.06.19    

답변 감사합니다!
답해주신 내용들 참고해서 다시 실험 검토해보도록 하겠습니다.

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