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레벨5
Marine
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17.06.06 23:25
1. 초기에는 DNA 를 Shearing 하기 위해서 제한효소를 많이 썼지만, 제한효소는 서열특이적 이기때문에 이문제를 해결하기 위해 최근에는 대부분 Sonicator 를 활용하여 초음파 분쇄로 물리적으로 절단시킵니다.
2. 일반적인 High fidelity polymerase 을 사용 합니다.
https://www.illumina.com/documents/products/techspotlights/techspotlight_sequencing.pdf
참고 하시고
자세한 온도 조건등은 나오지 않지만 아무래도 말씀하신 것에서 크게 벗어나지 않을 것 같습니다.
3. 말씀하신 DNA 순서를 아는 과정을 de-novo genome assembly 라고 합니다.
간단하게 말해서 짧은 DNA 조각들을 겹치는 서열들을 바탕으로 이어붙여서 순서를 알게 됩니다.
이부분은 구글에서 Shotgun genome sequencing 등으로 검색하면 많은 정보를 얻으실 수 있습니다..
1. restriction enzyme을 쓰는 특별한 application이 있지만 기본적으로는 sonication이 기본 방식입니다. 원래부터 대부분 그렇게 해왔구요.
2. 네 클러스터를 만들어서 나중에 signal을 강하게 내보내게 만듭니다. cluster가 너무 작게 형성되면 당연히 시그널이 약해져서 검색이 불가능해지고 반대로 너무 커서 다른 cluster와 오버랩이 되어 버리면 나중에 image analysis를 해서 cluster 간격을 구별할 수 없게 되어 데이터를 버리는 결과가 나오죠. 제가 알기로도 cluster formation은 특별할 것 없는 PCR 과정인 것으로 알고 있습니다. High fidelity Polymerase를 써도 error rate을 피할 수 없기때문에 나중에 소프트웨어적으로 처리를 하는 문제가 있습니다. 아마도 이부분이 현재 2nd generation NGS의 가장 큰 한계라고 보심 됩니다.
3. 제가 알기론 기존에 reference genome을 만들 때는 Sanger같은 전통적인 방식으로 라이브러리를 sequencing해서 나중에 assembly를 했던 걸로 알고 있습니다. 2nd generation NGS도 비슷한 개념인데 한가지 한계가 아직까지는 read length가 100 bp 안팎이라는 건데요. 기존방식보다 reads 생성 속도는 훨씬 빠른데 de novo assembly가 더 어렵다는 한계가 있죠. 많은 computational tool 들이 나와있는데 많이 intensive한 computation이 필요하고 쓸만하긴 하지만 정확도는 아직 많이 낮습니다.
아무튼 앞으로
long read /
low error rate sequencing이 차세대 sequencing 기술 발전의 지향점이라고 보심 됩니다...좋은 질문 해주셨네요 ^^