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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 cytosol, nuclear extraction 프로토콜 만들어봤습니다. 조언부탁드립니다.
개구리상후니(대학원생)  |  2017.05.23 14:25
 

저는 rat skeletal muscle로 실험하는데, 거의다 Cell 실험에 특화된 프로토콜밖에 찾을수 없어서, 이것저것 뒤져서 종합해서 만들어봤습니다..

혹시 보시고 지적해주실것 있으시면 조언 부탁드립니다.


버퍼조성:
- Cytoplasmic Extract (CE) buffer: (HEPES [10 mM] pH 7.9, KCl [10 mM], EDTA [0.1 mM], NP-40 0.3% (add just before use), protease inhibitors 1x (add just before use))

- Nuclear Extract (NE) buffer: (HEPES [20 mM] pH 7.9, NaCl [0.4 M], EDTA [1 mM], Glycerol 25%, protease Inhibitors 1x (add just before use)) 

1. 얼음에서 조직에 차가운 PBS 1 mL넣고 500 x g, 5분 후 PBS를 파이펫으로 최대한 제거해준다.

2. CE버퍼+inhibitor cocktail (조직 1 : 버퍼 9)를 넣고 조직을 최대한 잘게 자른다.

3. 10초간 homogenize 하여 덩어리 없이 최대한 갈아준다.

4. 4°C, 1,200 x g, 10 centrifuge 하고, Sup 새 튜브로 옮긴다. (pellet 버림)

5. 4°C, 10,000 x g, 10. (nuclear pellet 약하니 주의) Sup 모아서 -70°C 보관
  (Cytosolic protein)

6. NP-40가 없는 CE 버퍼 200 μLresuspend 한다.

7. 4°C, 3,000rpm, 5centrifuge 한다. - Sup 제거

(nuclear pellet을 더 잘 씻으려면 5, 6번 반복한다.)

8. pelletNE 버퍼(tissue 100mg -> 200ul) 넣고 pellet 조심히 풀어준 후

4°C, 10분간 incubate 시키고, 중간중간 vortex해준다.

9. 4°C, 10,000 x g, 5

10. Sup 모은다. (Nuclear protein), 분석 또는 -70°C 보관.

#extraction
 
#프로토콜
 
#웨스턴
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앞다리뉴앱  |  2017.05.24   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
4번단계에서 pellet에 nucleus가 포함되어 있습니다. 버리면 안되죠. 4번에서 얻은 Sup이 cytosolic fraction이 되겠고, 펠렛을 잘 워싱하여 NE버퍼에 녹여낸후 Sup을 얻으면 그것이 nucleus fraction이 되겠습니다.
개구리상후니  |  2017.05.25   
  뉴앱님 답변감사합니다!!

제가 햇갈려서 그런데, 괜찮으시면 한번더 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ

질문1. 4번에서 약하게 돌려서 무거운 조직pellet을 빼내고, 5번에서 나온 Pellet을 사용하는 것이 아닌가요? 아니라면, 4번에서 약하게 한번 돌리지 않고 바로 쌔게 돌려서 Sup 따는게 낫지 않을까요?

질문2. 4번에서 나온 pellet에 NE버퍼로 사용하고 5번에서 나온 pellet은 버리는건가요?

두 부분이 햇갈려서 질문드렸습니다. 답변 다시한번 감사드립니다...ㅠ.ㅠ
앞다리뉴앱  |  2017.05.25   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

 질문1. 4번에서 약하게 돌려서 무거운 조직pellet을 빼내고, 5번에서 나온 Pellet을 사용하는 것이 아닌가요? 아니라면, 4번에서 약하게 한번 돌리지 않고 바로 쌔게 돌려서 Sup 따는게 낫지 않을까요?


4번의 목적이 세포막이 깨지지 않은 조직을 제거하기 위함인데, nucleus의 loss가 생깁니다. electric homogenizer로 잘 갈아주시면 4,5번에서 두번 원심분리 할 필요없습니다. 10000g 1분하시는 것을 추천합니다
10000g 10분이면 핵 깨집니다


질문2. 4번에서 나온 pellet에 NE버퍼로 사용하고 5번에서 나온 pellet은 버리는건가요? 두 부분이 햇갈려서 질문드렸습니다. 답변 다시한번 감사드립니다...ㅠ.ㅠ

4번5번에서 한번만 원심분리해서 상층을 얻은것이 cytosolic fraction이고 펠렛에 nucleus가 있습니다.

contamination없이 완벽히 분획하기는 힘듭니다. 특히 조직에서. 예비실험으로 조건검토하시길 바래요.

개구리상후니  |  2017.05.25   
정말 감사합니다.!!!

많은 도움되었습니다. ㅠㅠ
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