[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
라이카써머캠프
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
조회 2921  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cytosol, nuclear extraction 프로토콜 만들어봤습니다. 조언부탁드립니다.
개구리상후니(대학원생)  | 2017.05.23 14:25
 

저는 rat skeletal muscle로 실험하는데, 거의다 Cell 실험에 특화된 프로토콜밖에 찾을수 없어서, 이것저것 뒤져서 종합해서 만들어봤습니다..

혹시 보시고 지적해주실것 있으시면 조언 부탁드립니다.


버퍼조성:
- Cytoplasmic Extract (CE) buffer: (HEPES [10 mM] pH 7.9, KCl [10 mM], EDTA [0.1 mM], NP-40 0.3% (add just before use), protease inhibitors 1x (add just before use))

- Nuclear Extract (NE) buffer: (HEPES [20 mM] pH 7.9, NaCl [0.4 M], EDTA [1 mM], Glycerol 25%, protease Inhibitors 1x (add just before use)) 

1. 얼음에서 조직에 차가운 PBS 1 mL넣고 500 x g, 5분 후 PBS를 파이펫으로 최대한 제거해준다.

2. CE버퍼+inhibitor cocktail (조직 1 : 버퍼 9)를 넣고 조직을 최대한 잘게 자른다.

3. 10초간 homogenize 하여 덩어리 없이 최대한 갈아준다.

4. 4°C, 1,200 x g, 10 centrifuge 하고, Sup 새 튜브로 옮긴다. (pellet 버림)

5. 4°C, 10,000 x g, 10. (nuclear pellet 약하니 주의) Sup 모아서 -70°C 보관
  (Cytosolic protein)

6. NP-40가 없는 CE 버퍼 200 μLresuspend 한다.

7. 4°C, 3,000rpm, 5centrifuge 한다. - Sup 제거

(nuclear pellet을 더 잘 씻으려면 5, 6번 반복한다.)

8. pelletNE 버퍼(tissue 100mg -> 200ul) 넣고 pellet 조심히 풀어준 후

4°C, 10분간 incubate 시키고, 중간중간 vortex해준다.

9. 4°C, 10,000 x g, 5

10. Sup 모은다. (Nuclear protein), 분석 또는 -70°C 보관.

#extraction
 
#프로토콜
 
#웨스턴
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
앞다리뉴앱  |  2017.05.24   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
4번단계에서 pellet에 nucleus가 포함되어 있습니다. 버리면 안되죠. 4번에서 얻은 Sup이 cytosolic fraction이 되겠고, 펠렛을 잘 워싱하여 NE버퍼에 녹여낸후 Sup을 얻으면 그것이 nucleus fraction이 되겠습니다.
개구리상후니  |  2017.05.25   
  뉴앱님 답변감사합니다!!

제가 햇갈려서 그런데, 괜찮으시면 한번더 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ

질문1. 4번에서 약하게 돌려서 무거운 조직pellet을 빼내고, 5번에서 나온 Pellet을 사용하는 것이 아닌가요? 아니라면, 4번에서 약하게 한번 돌리지 않고 바로 쌔게 돌려서 Sup 따는게 낫지 않을까요?

질문2. 4번에서 나온 pellet에 NE버퍼로 사용하고 5번에서 나온 pellet은 버리는건가요?

두 부분이 햇갈려서 질문드렸습니다. 답변 다시한번 감사드립니다...ㅠ.ㅠ
앞다리뉴앱  |  2017.05.25   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

 질문1. 4번에서 약하게 돌려서 무거운 조직pellet을 빼내고, 5번에서 나온 Pellet을 사용하는 것이 아닌가요? 아니라면, 4번에서 약하게 한번 돌리지 않고 바로 쌔게 돌려서 Sup 따는게 낫지 않을까요?


4번의 목적이 세포막이 깨지지 않은 조직을 제거하기 위함인데, nucleus의 loss가 생깁니다. electric homogenizer로 잘 갈아주시면 4,5번에서 두번 원심분리 할 필요없습니다. 10000g 1분하시는 것을 추천합니다
10000g 10분이면 핵 깨집니다


질문2. 4번에서 나온 pellet에 NE버퍼로 사용하고 5번에서 나온 pellet은 버리는건가요? 두 부분이 햇갈려서 질문드렸습니다. 답변 다시한번 감사드립니다...ㅠ.ㅠ

4번5번에서 한번만 원심분리해서 상층을 얻은것이 cytosolic fraction이고 펠렛에 nucleus가 있습니다.

contamination없이 완벽히 분획하기는 힘듭니다. 특히 조직에서. 예비실험으로 조건검토하시길 바래요.

개구리상후니  |  2017.05.25   
정말 감사합니다.!!!

많은 도움되었습니다. ㅠㅠ
답변하기
할인행사 광고 검색광고
다온비에스 다온비에스
[DNAGenotek] Oragene Collection kit 무료샘플 사용해보세요!! (7.31까지)
다온비에스 다온비에스
[DNAGenotek] Omnigene·GUT Collection Kit 무료샘플 사용해보세요!! (7.31까지)
브래디 브래디
초저온라벨 등 실험실용 풀칼라프린터 (COVID-19 안전사인 지원) (8.30까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
High Multiplex RNA/Protein Expression Analysis System / taco.. (12.24까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
[TECAN] Reading과 형광 Imaging을 하나의 장비로 한 번에!! [Multi-mode micr.. (8.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 상반기 프로모션 안내 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (8.8까지)
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
4/6  좌우
49,000
17,000
370,000
79,50075,600
139,000132,100
66,50063,200
23,000
130,500124,000
6,000
482,000
339,400322,500
773,000734,400
739,000702,100
109,000
52,60050,000
136,000129,200
92,30087,700
93,20088,600
125,500119,300
143,800136,700
482,000
47,20044,900
493,000
468,000
최근등록   더보기 >
구강 세균 채취, 도말   07.10
PDA배지에 세균배양 가능한가요?   07.10
혹시 컨탐일까요?   07.09
EMSA에서 u자형 밴드가 아니라 직선형 밴드를 얻으려면 어떻게 해야하나요?   07.09
TA cloning   07.09
his-tag 정제 후 단백질 농축 질문드립니다!   07.09
이 미생물이 뭔지 알 수 있을까요?   07.09
western bolt background가 너무 진해요   07.09
PCR밴드 안 나올 때.도와주세요.   07.09
1X TAE   07.09
울산대학교 의과대학
제품평가
[비아이코퍼레이션]
e브릭몰(연구용 제품 온라인 구매 사이트)
비아이코퍼레이션
모집인원: 50명
모집기간: ~7/15까지
신청조건: BRIC 회원
평가자 혜택

- 참가자 전원 3만원 상품권 제공

제품평가자 모집중
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크