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 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
조회 1963  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 RNA isolation 중 laddering이 나옵니다
알루시에르(대학생)  |  2017.05.11 14:57
Real time PCR을 위해서 RNA isolation 중인 학부생입니다.

두 번째 isolation 진행했는데 계속 laddering이 나타나서 질문드립니다.

교수님은 RNA가 깨져서 그렇다고 하시는데 

RNA가 깨졌는데 이렇게 마커처럼 깨끗한 laddering이 나올 수 있나요?

농도가 낮아서 그렇지 A260/280은 1.8 잘 넘어가는 애들도 영동 걸면 저렇게 나오니

반 돌아버리겠어요...ㅋㅋㅋ 고수님들 저를 살려주세요 ㅠㅠ

ps. 집에 와서 사진 새로 음영처리 해서 올려요 ㅠㅠ

upload image
#laddering
 
#rna isolation
 
#real time pcr
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개구리Marine  |  2017.05.11   
 무엇을 전기영동 하신거죠?

Total RNA 를 전기영동 하신건가요??
RNA가 깨지면 쭈욱 늘어지는 smear한 밴드가 나오기 마련인데

와 이렇게 나오는 경우는 저도 처음보네요...
전부다 사이즈도 비슷한데...
Size marker 를 잘못거신거 아닐까요....??
개구리Marine  |  2017.05.15   
 다시 보니까
Size marker 즉 Ladder 를 Loading dye 로 착각하시고 전기영동 하신거 같네요..
아니면 RNA가 깨졌다고 해서 이렇게 나올 수가 없을거같아요...
알루시에르  |  2017.05.19   
네 total RNA입니다! 28S 18S 5S 세개로 나와야 할 밴드가 저 모양이라 머리가 너무 아프네요 ㅠㅠ

저도 혹시나 ladder 썼나 싶어서 시약들 다 체크해봤는데 dye로 loading star를 사용했어요 ㅠㅠ

다른 대학원생도 분주해놓은 dye 중 저와 똑같은 넘버의 dye를 사용했구요... (결과는 좋았어요)

그래서 실험실의 모든 사람들이 현재 멘붕상태에요... 허허
specific  |  2017.05.20    

RT-PCR of _____ gene? (base pair size = ?)



밴드가 1개만 나와야죠. 여러개 나온다는 것은



1) there is no specificity

2) Not clear which band your target amplicon should be located.

3) In real time RT-PCR, there is "Melt curve analysis" option. Please do that. IF there is only one single peak in melt curve, your pcr reaction is specific enough and there is no primer-dimer problem. If not, your PCR reaction is problematic.

Overall: your electrophoresis gel displayed that there are multiple non-specific bands. Your rt-pcr was not performed as desired or as expected in usual setting.

Prediction: why problematic?
1. Your RNA quality is bad? Which method did you use? Trizol/qiazol based or not?
2. Your primer is not good (for example, you are using a primer designed for genomic DNA/genotyping purpose, when your aim was to assay mRNA expression using RNA.
3. Please explain - which gene, which exon, which part of the region you are sensing using which forward and backward primer?

개구리Marine  |  2017.05.21   
 This electrophoresis figure is not PCR product but total-RNAs...


허허 Size marker 인 줄 알았는데 그게 아니라면 정말 귀신이 곡할 노릇이네요..;;
이렇게 일정하게 ladding 이 되는건 처음 봅니다.
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