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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 subcellular fractionation
알팔콘펀치(대학생)  |  2017.03.30 16:55

흐엉 안녕하세요 실험실에서 공부하고있는 학생입니다.

제가 이번에 Hela cell과 Cardiac Fibroblast primary cell 을 가지고

nucleus, cytoplasm, cell membrane(plasma membrane)으로 분리를 하고

제가 찾는 protein이 어떤 size에 나오는지 확인하고자 하려고 실험을 하고있습니다.

이 실험을 4번정도 진행했는데... membrane에서 나와야 될 protein band 들의 대부분이

nucleus lysate에서 나왔습니다ㅠㅠ

같이 첨부하는 protocol의 step3에서 agitate 시간을 1h으로 늘리고 10분마다 20번정도

suspension을 해주었고. step 7에서 nucleus pellet washing은 5번정도 반복해 주었습니다.

나머지 실험조건이나 buffer등은 동일한 것을 이용하였고, buffer의 조성이나 pH등은 모두

점검을 하고 실험을 진행했습니다...ㅠㅠ

그런데 도무지 washing을 늘리고, agitate를 늘려주어도 방법을 모르겠습니다.

혹시 이 fractionation 실험을 해보신 분들께서 조언해 주실 만한 이야기 가 있으시면

어떤 것이든 부탁드립니다!!

제 실험 결과입니다..ㅠ



여기 사용한 antibody가 transmembrane protein이여서 membrane lysate에서만
나오길 기대했는데 nucleus에서도 나와버렸습니다..ㅠ 예상 size는 515kDa이에요


Protocol입니다! BIO-PROTOCOL이라는 site에서 얻었습니다.