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insoluble protein 은 이미 제대로된 3차구조를 갖지 못하고 있는 경우라고 봅니다.
denaturation된 것과는 좀 다르지만 원래의 구조를 만들지 못했다는 의미지요.
이런 단백질로 항체를 만들면 원래 단백질의 3차 구조에 붙는 항체일수도 있지만 변성된 구조나 1차구조에 붙는 sequential 항체일 가능성이 큽니다.
그런 항체를 사용하면 WB는 됩니다.
WB 할때는 어차피 변성된 단백질을 대상으로 하는거니까요.
그러나 IP는 전상적인 3차 구조를 가지는 단백질을 대상으로 하는 것이므로 대부분의 경우 IP가 안됩니다.
즉, 님이 만든 항체는 아마도 변성된 단백질에 붙는 WB 용 항체이며 정상적인 3차구조에는 붙지 못하는 항체입니다.
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레벨2
명성황후
(대학원생)
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17.03.24 09:45
강시님 감사합니다. 그런데 IP할때 Lysate자체를 denaturation상태로 바꿔줘서 반응시켜도 소용이 없는건가요?? 펴진상태는 잡으니까 말이죵..
미흡하나마 저도 답변해보겠습니다.
질문1 : Insoluble protein으로 antibody를 만드는 경우 보통 IP가 되지 않는건가요? (IP는 soluble protein과 antibody가 반응하는 실험이라서)
- 강시님께서 잘 설명해주신 것 같습니다.
질문2 : western blot이 됬다고 해서 IP가 무조건 되는건 아닌가요?
- 네.Western blot의 원리에 따라서 생각해보시면 되겠습니다.
SDS 샘플버퍼를 넣고 끓이게되면 protein의 2,3,4차 구조가 깨어지고
linear한 1차 구조로 denature됩니다. 따라서 Western blot에 성공한
안티바디는 a.a의 sequence를 인식하고 affinity를 갖는다는 것을 시사합니다.
IP의 경우 antigen의 nature form을 잡는 것이기 때문에 western blot에서
affinity를 갖았던 a.a sequence가 nature form에서는 affinity를 잃게 될 수 있습니다.
질문3 : Antibody와 lysate 비율이 중요한가요? 그리고 bead에 먼저 antibody를 binding시키는 것보다 먼저 lysate와 antibody를 반응시키고 bead에 붙이는게 낫나요?
- 이부분은 잘 모르겠네요.. commercial한 antibody들 찾아보시면 WB용 희석농도와
IP용 희석농도가 다른 경우가 있는데 한번 참고해보세요.
경험적으로 bead에 먼저 붙이고 한 것이 더 잘나왔던것 같습니다만, 이는 안티바디마다
조금씩 다를 수 있다고 생각이 됩니다.
질문4 : 만약에 IP가 되어 조금이라도 제 Target antigen이 같이 elution되지만 이게 너무 소량이라서 쿠마시블루로 staining이 안되고, western상에서는 보이는 경우가 있나요?
- 네, western blot의 경우에도 일반적인 ECL로는 안보이다가 signal을 더 강하게
해주는 시약을 사용하면 그제서야 보이는 경우도 있습니다. 이런 경우에는 IP용 cell을
더 많이 뿔린 후에 다시 실험하면 밴드가 더 뚜렷해졌던것 같습니다.
질문5 : 제가 지금 ip를 하는 목적이 lysate, 즉 native한 cell상태에서 발현된 target protein을 잡을수 있는지 없는지를 확인하고자 하는건데, 이러한 목적으로도 이 실험을 하는건가요? 저는 antibody가 같은것을 쓰는거라면 western blot이나 IP나 같다고 보거든요. IP에서 나온 밴드의 결과가 Antibody와 antigen affinity가 더 좋고 정확하다고 판단할수 있는건가요? 저희 교수님께서 western blot에서 나온밴드가 정말 내가 생각하는 target의 protein이 아니라 다른건데 antibody가 잡은걸수도 있으니 IP를 통해서 확인하고, 그 밴드가 사이즈가 일치하게 되면 Targen protein 으로 생각하는거라고 하셨거든요... IP는 정말 specific한 애들만 잡는거라고 하셔서...
- 잘 모르겠습니다.
제 부족한 식견으로는 Western blot과 IP 중에서 antibody가 target을
specific 하게 잡는지를 검증함에 있어서 둘 중 어느것이 더 확실한 방법이다라고
생각되지는 않습니다. western blot의 경우 a.a sequence 특이적이며
IP의 경우 최종적인 protein strucuture 특이적이지요. 둘 모두 non-spepcific한
노이즈가 있을 수 있다고 봅니다. 다만 두 실험 모두에서 잡은 밴드가 size가 갖다면
좀더 확실한 증거는 될 수 있다고 생각해요.
DNA를 구할 수 있다면 널리 쓰이는 tagging을 하여 overexpression 및 knockout을
통해서 확인하는 것도 한 방법이 될 것 같습니다.
추가 질문에 대한 답 :
lysate를 denaturation을 시키신다면 solution에 아마도 단백질의 구조를
깨뜨리는 성분이 함께 존재하겠지요. 따라서 antibody 구조 또한 망가져서
binding이 되지 않을 가능성이 높습니다.
denature된 프로틴들만 따로 정제해서 IP를 하시더라도 Western blot과
다를바가 없는 실험이리라 사료됩니다.
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레벨2
명성황후
(대학원생)
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17.03.30 18:24
헿헿님 감사해요 많은 도움이 되었습니다~