실험 Q&A Chemical biology > Extraction/Concentration
고수님들 저희 랩에서 처음으로 histone extraction을 시도하려고 합니다.ㅠㅠ
레벨1 김민주90 (대학원생)
extraction은 abcam의 프로토콜대로 acid extraction을 하였습니다.
1. Harvest cells and wash twice with ice-cold PBS. PBS can be supplemented with 5mM Sodium Butyrate to retain levels of histone acetylation.
2. Resuspend cells in Triton Extraction Buffer (TEB: PBS containing 0.5% Triton X 100 (v/v), 2mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.02% (w/v) NaN3) at a cell density of 107 cells per ml.
3. Lyse cells on ice for 10 minutes with gentle stirring.
4. Centrifuge at 2000rpm for 10 minutes at 4°C. Remove and discard the supernatant. 5. Wash the cells in half the volume of TEB and centrifuge at before.
6. Resuspend the pellet in 0.2N HCl at a cell density of 4x107cells per ml.
7. Acid extract the histones over night at 4°C.
8. Centrifuge samples at 2000rpm for 10 minutes at 4°C.
9. Removed the supernatant and determine protein content using the Bradford assay.
10. Store aliquots at -20°C.
궁금한 점은 extraction 후 western을 하려고 하는데 일반 protein으로 western을 하는 방법과 동일하게 해도 되는지 궁금합니다.
저희 랩에서는 sample buffer(with SDS)는 2x or 5x를 사용하여 boiling 한 후, SDS-PAGE gel에 로딩 후 running buffer(with SDS)를 이용하여 running하고 transfer buffer(Tris-Glycine w/o SDS)를 사용합니다. 그 후 skim milk로 1st, 2nd antibody를 develop 합니다.
이 과정과 동일하게 extraction을 로딩하여 확인하면 되는 것인지, 혹시 또 다른 주의사항이 있는지 궁금합니다. 꼭 알려주세요!!!!!!ㅠㅠ
Bio마켓 프리미엄