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프로토콜 세포 동결에 관련된 노하우를 공유해 주세요
foxylove  |  2015.12.16 11:10
세포 동결에 관련된 노하우를 공유해 주세요 세포를 오랫동안 보관하기 위하여 세포를 동결된 상태로 보관하게 됩니다. 동결 조건이나 방법에 따라 세포 생존율이 많이 달라지고 후에 진행되는 실험에도 영향을 주게 되므로 세포 동결은 관련 실험에서 매우 중요한 부분이라 할 수 있습니다. 세포를 좋은 컨디션을 유지하도록 동결 보관 할 수 있는 실험 방법, 재료, 기계류 등등 관련 노하우를 공유해 주세요

제안자  foxylove  (2015.12.16)


(본 자료는 예전 실험Talk에서 이관되었습니다.)


[관련자료 링크]

 http://prezi.com/lrniphxmzefh/?utm_campaign=share&utm_medium=copy&rc=ex0share

분홍개구리 프리드만 (2016-06-29 17:39)


[나만의 노하우]
굳이 노하우라 하자면

아무래도 동결액 자체에 cell에 damage주는 DMSO 등이 포함되어있기때문에

최대한 빨리 deep freezer에 넣어주는것이고

1분동안 1도가 떨어지는 탱크 비슷한 것이 있는데요,

거기에 vial을 우선 두고 -70도 보관했다가

LN2로 cell stock을 옮기는 것입니다.
yeon (2016-02-16 13:54)


[관련제품]

이전 실험실에서 cell stock 만들 때

FBS와 DMSO를 따로 첨가해주어야해서 불편함이 있었습니다.

그런데 이 제품은 바로 cell을 down시켜 이 solution에 풀고

바로 vial에 넣어 deep freezer 혹은 LN2 보관가능하여 편합니다.

저도 처음사용해보았으나 cell을 다시 풀었을 때 viability도 나쁘지 않았습니다.

첨부파일 내려받기 30-1468_BAMBANKER.pdf (315 KB)
yeon (2016-02-16 13:51)


[관련제품]

Revive Organtech은 미국 CA,얼바인시에 소재한 바이오텍 입니다.
세포동결에는 일반적으로 FBS+10% DMSO를 혼합한 제제를 홈메이드 방식으로 사용하고 있습니다. 위의 방법은 수십년동안 세포주들을 동결보존하는데 값싸고 문제없이 사용이 되었습니다.
하지만 현재 FBS을 사용하는 홈메이드 방법에는 여러가지 문제가 있는것이 현실입니다.
첫번째로 FBS의 가격이 계속적으로  급등함으로 인해 동결보존액에 FBS를 사용하는것이 부담으로 작용하고 있습니다. 또한 혈청을 이용해 제작한 홈메이드 동결보존액의 제조후 sterility유지한는것이 매우 어렵고, pH변화가 있어서 제조후 2주이내만 사용이 가능하기 때문에 만든후 쓰지 못한 많은 양이 사용되지 못하는 단점이 있습니다.

두번째 FBS는 근본적인 문제가 있는데 이것은 FBS가 nutrients가 다량으로 들어있어 항상 bacterial contamination에 취약한 단점을 가지고 있습니다. 이를 막기 위해 항생제를 넣어주지만 세균감염을 100% 막아줄수는 없습니다.

위의 문제를 해결한 제품이 Revive Organtech사의 Cryo-GOLD입니다.
Cryo-GOLD는 serum free, protein free, animal origin free, fully defined 동결 보존액입니다.
Cryo-GOLD는 두가지 큰 특징이 있습니다.

Bacterial contamination free and DMSO toxicity free cell/tissue freezing media입니다.

위 제품을 사용하시면 저렴한 가격과 편리함 그리고 높은 효율, 사용의 장점들로 인해 중요한 cell stock을 보관하는데 많은 도움이 될것으로 사료됩니다.



현재 위 제품은 Stemgent, Allcells, System Bioscience, MIT iPS core, Salk Institute, ReproCELL, USC, UC Irvine, Invitrix, Thermo Scientific사등에서 사용되고 있습니다.

홈페이지:www.reviveorgantech.com

첨부파일 내려받기 Thermo-GOLD and Cryo-GOLD brochure.pdf (1.12 MB)
Revive Organtech, Inc (2016-02-09 11:25)


[나만의 노하우]

마치 제품 홍보 스럽지만 Z모사에서 나오는 셀X커 (영어지만 홍보하는 것 같이 짙어보일까봐서 한글로; 저는 그냥 일반 연구원입니다~)

요즘 FBS, BCS 등등의 가격이 올라가면서

점점 cell freezing에서 serum을 넣는 것도 아끼고 싶고

cell 을 freezing container에 isopropyl-alchohol 넣고 냉장고 옮겼다가

다시 deep freezer에 다시 넣는 게 귀찮고 까먹고 갈 때가 가끔 있는데

때론 이런 제품도 아주 유용하다고 생각합니다.

일정량의 셀 수를 centrifuge하고 셀 수만큼 시약을 넣고 바로 deep freezer에 넣어 -70에

보관하면 동결보존이 끝나더라구요.

cell culture 하시는 분들 중에 이런 방식의 스케쥴 관리가 필요하다면

이용해보시는 것도 좋다는 생각이 드네요.

물론 serum과 DMSO가 포함된 제품이라 다시 thawing 할 때 빨리 구출하는 과정은 같더라구요.

청개구리 멍멍곰 (2016-01-22 15:41)


[나만의 노하우]
1. Resuspend cell pellets in cryosolution 1 (100% FBS) i.e. 1x10^6 - 1x10^7 cells /ml
2. Add and mix with equal volume of cryosolution 2 (20% DMSO + 80% FBS)
3. Put the tube(s) in the Mr. frosty and store overnight in the deep freezer (-80 degree) for a gradual temperature drop (see the link below)
4. 24 hr later, move the tubes to LN2

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c1562?lang=en®ion=AU
wehi (2016-01-12 15:17)


[나만의 노하우]

안녕하세요~
Mammalian cell 을 가지고 연구하고 있습니다~
대부분 이전의 DMSO 사용부터~ 요즘의 anti freezing agent 에 이르기까지
각자 나름의 재료들이 있을거라 생각되는데요~

1. DMSO 농도 : 10%
여러 암세포 cell line, MEF, 신경세포주 등등 stock 해보았으르 때 DMSO 농도는 10 % 가 가장 좋았습니다

2. FBS 농도 : 40%
세포 배양시 배지에  첨가되는 그 FBS! 장기보관할 시 FBS를 40 % 첨가하면 좋았습니다.

3. 세포 농도 : 50%
총 1 ml vol.으로 만들 때 stock만들 세포를 down 시킨 후, antibiotics +/FBS + media를 500 ul 넣어 부유시킨 후 만들면 좋았습니다

4. 종합 의견
위와같은 농도로 하되,
1) DMSO와 FBS는 mixture를 만들어서 세포를 부유시킨것과 섞는 것이 좋습니다
2) 섞을 때 pipetting을 충분히 해줍니다
3) 녹일 때는 37 도 water bath에서 단시간에 녹이고, 얼음이 살짝 보일때 꺼냅니다
4) antibiotics +/FBS + media 13 ml이 든 conical tube에 cell mixture를 한방울 씩 떨어뜨린 후,  spin down 합니다

알 chungchu (2016-01-07 16:09)


[나만의 노하우]
세포 동결 by 홀리 스피어
1. 동결 세포 종류 : HDF, HeLa, U2OS, 293T(N), RPE-1, MEF 등 대략 30여종 이상.


2. 세포 보관 기간 :
- 질소(LN2)탱크 보관 시 장기 보관 (단, 질소의 양이 적절히 유지 되어야함)
- 약 -70도 Deepfreezer 에서 2개월로 잠시 보관한 후 다시 풀 때 사용. (최고 6 ~ 12개월이지만 damage를 받는 것같음 : Cell death나 cycle delay 등의 영향을 주는 것을 확인).


3. 세포 동결 시 세포의 density (1~10*106 정도). 일반 적으로 100 cm2 dish에 70~80%
(너무 많을 경우 condition 저하, 어는 속도 변화에 따른 damage, 적을 경우 이상 없었음)


4. 동결 방법
(1) 100 cm2 dish 세포70~80% density로 배양한 뒤 1 dish당 1 cryo tubue를 준비
(2) Harvest 후 spin down 하고 media를 버림.
(3) DMSO(외부에서 뚜껑 열지 않은 것), Fetal bovine serum(FBS) 준비 후 10%+90%로 섞음 (FBS 비율은 30%까지 줄여도 되지만 DMSO는 10~15% 유지. 나머지는 Culture media대체 가능). 저희 랩에서는Primary cell line은 FBS 90%로 얼립니다.
(4) 섞은 freezing media를 pellet에 잘 resuspending하고 tube에 옮김 (1 tube당 1ml로 만듬)
(5) 세포를 얼릴 때 중요한 점: 1분당 1도씩 내려가게 하기.
방법 1 : 적절한 굵기의 스티로폼 박스나, 티슈를 cryo tube 주위를 감싼 뒤 -20도 냉장고에 1~2시간 보관 -> -70도 deepfreezer에 overnight -> 질소(LN2) 탱크로 이동
(일정한 속도로 내려가진 않지만 어느정도 안정적인 방법)
방법 2 : 50ml conical tube에 Isopropanol을 넣는다 (Isopropanol은 냉동시 분당 1도씩 떨어지는 것으로 알고있습니다.) -> Cryo tube에 연필로 라벨링한다.(Isopropanol에 넣으면 일반적인 펜이나 잉크류는 쉽게 지워집니다.) -> tube를 conical tube에 집어넣는다 -> -70도 deepfreezer에 overnight한다 -> LN2 탱크로 이동 (일정한 속도로 내려가나 여러 개를 할 경우 손이 많이가고 연필로 labeling 해야한다.)
방법 3 : Thermo에서 판매 하고잇는 Isopropanol을 이용한 Cell freezer인 Mr. Frosty Freezing Contaner를 사용한다. 1ml과 5ml전용 박스가있는데 둥근 모양이며 한번에 18개를 넣을 수 있다. (사용법은 방법 2와 같으나 Isopropanol을 겉면에 넣고 씌운뒤 vial을 넣기 때문에 펜으로 labeling하여도 지워지지 않고 편하게 많은 cell을 얼릴 수있다. (장점 : 일정한 속도로 온도가 내려간다. 단점 : Isopropanol을 사용할 경우 비용이 지속적으로 들며, 냄새 처리 문제 등이 있다.)
방법 4 : CoolCell® LX 를 사용한다. Isopropanol 과 같은 alcohol을 사용하지 않고 단순한 열 보호 작용을 이용하는 것같다. 스티로폼 같은건데 딱딱하고 아무런 부가 재료가 들어가지 않고 단순히 cryo tube 12개정도를 넣고 사용하는데 대단히 편하다. 바로 -70도 deepfreezer에 넣은 뒤 overnight 하고 꺼낸 뒤 질소 탱크 옮기면 된다.


5. DMSO를 사용하는 이유
세포 동결시 세포내 물 분자가 수소 결함에 의해 얼면서 Ice crystal현상이 일어나면 뾰족한 모양을 하면서 어는 intracellular ice crystalization이 일어나는데, 때문에 세포에 큰 damage를 줄 수 있다. 하지만 DMSO를 넣게 되면 이러한 수소 결합을 어느 정도 방해하여 뾰족한 결정이 생기지 않게 해준다. 게다가 Glycerol은 salt-buffer로 metallic ion에 결합함으로써 얼음 결정형성을 방해하지만 DMSO가 보다 M.W이 작고 toxic effect가 작기 때문에 최근에는 대부분 DMSO를 가장 많이 사용하는 동결 보호제로써 선호한다.
알 홀리스피어 (2015-12-31 16:04)


[관련제품]
안녕하세요. 서린바이오사이언스 입니다.
Cell freezing 시 사용할 수 있는 추천제품 안내 드립니다.

1. Freezing media
브랜드: wako
품명: Bambanker
특징: -20’C 에 pre-freezing 하지 않고 바로 deepfreezer 에 넣어도 되는 간편한 format

2. CoolCell
브랜드: biocision
품명: CoolCell
특징: 1분에 1도씩 온도를 떨어뜨려 cell damage를 최소화 하는 Freezing container

3. Thawstar
브랜드: biocision
품명: Thawstar
특징: water bath에서 cell을 녹일 시 발생할 수 있는 문제점을 극복하고, 표준화된 프로토콜을 제공하는 전 세계 유일한 thawing 장비

참고링크: http://www.seoulin.co.kr/shop/board/view.php?id=newtech&page=5&no=825

추가로 Biocision사에서는 샘플(Cell 포함)을 얼리고 녹이고 또 온도를 유지시키는데 필요한 대부분의 제품을 취급하고 있으며, 가장 표준화된 방법으로 샘플을 준비할 수 있도록 모든 solution을 제공하고 있습니다.

문의사항 있으시면 연락 부탁 드립니다.
대표번호 T.1670-5911
(주)서린바이오사이언스 (2015-12-29 17:50)


[기본원리]
안녕하세요. 서린바이오사이언스입니다.
일반적인 Cryopreservation step은 다음과 같습니다.


1. Collect and concentrate cells
- 배양 하고 있는 Cell을 harvest 하는 단계

2. Resuspend cell pellet in Cryopreservation media
- 세포를 안정한 상태로 보관할 수 있는 Freezing media로 Cell을 resuspension 시키는 단계

3. Controlled cooling -1℃/min to -80℃
- LN2에 바로 보관하기 전에 -80도까지 천천히 세포를 얼리는 단계로 초저온냉동고(deep freezer) 보관

4. Liquid nitrogen storage
- 장기적인 보관을 위해 액체질소로 옮기는 단계

5. Thawing cell
- 액체질소에 보관중인 세포를 다시 사용하고자 할 때, 세포를 해동하는 과정

각 단계에서 사용할 수 있는 제품은 "관련제품" 항목을 참고 부탁 드립니다.


문의사항 있으실 경우 연락 부탁 드립니다.
대표번호: 1670-5911
(주)서린바이오사이언스 (2015-12-29 16:20)


[나만의 노하우]
노하우라고 해야 할지 모르겠습니다만, cell freezing하는 방법으로는 상당히 간단하고 cell viability 역시 잘나오는 방법이라 소개하고자 합니다.
대개는 4도(냉장), -20도(일반냉동), -80도(저온냉동), 액체질소 순으로 가거나 isopropanol tank에 넣고 -80도에서 over night 후 액채질소에 넣는 방법을 사용하는 경우입니다.
저의 경우 위의 두가지 방법 모두를 사용해봤습니다. 전자의 경우 단계가 복잡하고 귀찮고, 간혹 냉장 보관 시간을 다른 실험을 하다가 놓치는 경우가 있어서 cell freezing이 실패하는 경우도 있습니다. 후자의 경우에는 isopropanol tank가 없거나 isopropanol이 떨어지는 경우에는 무용지물이 됩니다.
제가 하는 방법을 다음과 같습니다.
freezing medium: 50% culture medium + 40% FBS + 10% DMSO 

1. Detach the cell by trypsinization
2. Count the cell # and collect the cell with centrifuge (700 rpm, 3 min)
3. Resuspend the cell with freezing medium
4. Transfer 1 ml of cell suspension to cryovial tube
5. Insert the tube in styrofoam tube rack and store at -80oC over night
6. Transfer the tube in liquid nitrogen tank

아마 방법을 크게 다를게 없을 것입니다.
다만 highlight한 5번 단계에서 isopropanol tank 대신에 스티로폼으로 된 tube rack을 사용한다는 것입니다.
좀 더 구체적으로 설명을 드리면 똑같은 size의 스티로폼 tube rack 2개가 필요합니다. 
두 tube rack을 아래위로 겹치면 칸이 아래위로 일치하게 맞물리는지 확인하는 지 확인하고
서로 맞물린다면 아마도 밀착이 될 것입니다.
위의 rack이 준비가 되었다면 cryovial을 아래 rack에 꽂고 그 위에 다른 rack을 겹쳐서 덮으면 됩니다. 그리고 최대한 밀착을 시킨 후 tape로 겹쳐지는 부분을 돌아가면서 단단히 붙인 후
deep freezer에 넣으면 끝입니다.

isopropanol이 없어서 고민인 실험실이라면 추천하는 방법입니다.
저도 처음엔 의구심이 들었으나 한번 해보고 난 뒤에는 꿀팁이라는 생각이 들 정도로 괜찮은 방법입니다.
미국에서 학위하신 동료 박사님께서 알려주신 방법인데 참 유용한 tip인것 같습니다.

지금 우리 실험실에서 사용중인 tube rack을 사진으로 첨부합니다.
첨부파일 내려받기 20151228_085234[1].jpg (1.21 MB)
첨부파일 내려받기 20151228_085328[1].jpg (1.39 MB)
청개구리 식스센스 (2015-12-28 08:58)


[나만의 노하우]
일반적으로 DMSO, FBS, media를 혼합하여 주는 비율은 각 실험실 마다 다른데요,
저 같은 경우에는 DMSO는 10%를 고정하고, 나머지 FBS의 함량을 조절합니다.
FBS의 함량이 높을 수록 cell의 생존율과 더불어 좋은 컨디션을 유지하는데 중요한 것 같습니다.
더욱이 중요한 cell 일 수록 FBS 70% 이상으로 사용하여 얼리기도 합니다.
또 다른 노하우로는 다른 분들 역시 말씀하셨듯이, 동결 시간인데요, 세포를 얼릴때에는 가능한한
최대한 천천히 온도를 올려주어야 합니다. 그래서 예전에는 4도씨 24시간, -20도씨 24시간,
-80도씨 24시간 정도 보관 후 액체질소통으로 옮겼었습니다.

또 다른 한가지로는, 세포를 얼리는 것도 역시 중요하지만, 세포를 녹이는 방법 역시 세포의 생존율과 좋은 컨디션을 유지하는데 필수적인 요소입니다.
세포를 얼릴땐 가능한한 천천히 얼려주고, 반대로 세포를 녹일 때에는 가능한한 최대한 빨리 녹여주어야 합니다.

이러한 기본적인 것만 잘 지켜주기만 하여도 세포는 좋은 상태로 보관 할 수 있습니다.
한가지 팁을 드리자면, 세포를 얼릴 때 사용하는 cryo vial의 경우 뚜껑을 너무 꽉 잠그면, 나중에 세포를 녹일 때 폭발 할 수도 있으니, 잠기는 느낌이 딱 왔을 때 까지만 잠그시고, 액체 질소통에서 cryo vial을 꺼낼 때에는 꺼내자 마자 뚜껑을 살짝 열어 액체 질소를 밖으로 빼주어야 폭발하지 않습니다.
저 같은 경우 이러한 걸 잘 지키지 않아서 cryo vial을 꺼낼 때 마다 1~2개씩 폭발 하기도 합니다;;
청개구리 Daegu* (2015-12-17 20:11)


[나만의 노하우]
셀 동결에서 가장 중요한것은...
다른분들이 말씀하신것처럼 동결시약의 농도 조성도 중요하고 떨구는 온도 속도도 중요합니다.
그러나 가장중요한것은 액체질소의 양 아닐까 합니다.
대부분의 셀은 액체질소의 증기상태로 동결을 유지합니다. 간혹 질소 안에서 보관하는 경우도 있기는 하지만 이런경우에 바이알안쪽으로 액질이 들어가기도 합니다.
또 백업도 준비해야 겠죠... 이또한 다른분이 이야기를 하셨는데 초저온냉동고에서도 반년정도는 보관이 가능합니다. 저는 이렇게 양쪽으로 보관을 합니다.... 최소한의 보험처리죠..

결국 제 결론은 탱크안에 액질양과 셀 스탁의 백업보관이라 하겠습니다.
황금개구리 안재진 (2015-12-17 16:05)


[관련제품]
윗분 말씀처럼 요즘 Cell freezing medium을 사용하시는 분들이 많습니다. 대표적으로 Cell banker를 사용하는데 편리하나 가격이 비싸다는 단점이 있죠. 저희는 REVIVEORGANTEC社의 CRYO GOLD를 판매하고 있습니다. Primary cell등을 보관하실 때 FBS농도를 좀 더 많이 넣는 경우가 있는데 그 정도의 가격이라고 보시면 됩니다. 그리고 또 하나 2-8도의 냉장상태에서 세포, 조직을 1년동안 아무 피해없이 보관하실 수 있다는 겁니다. 관련내용은 링크된 내용 첨부자료를 보시면 좋을 거 같고 좀 더 자세한 문의사항은
www.insungscience.com으로 연락주세요 감사합니다.
http://www.ibric.org/myboard/read.php?id=113491&Board=new_protech
첨부파일 내려받기 QA-CRYO-GOLD.pdf (184 KB)
첨부파일 내려받기 CRYO-GOLD-사용설명서.pdf (143 KB)
첨부파일 내려받기 카다로그 Cryo GOLD.pdf (438 KB)
동결보존 (2015-12-17 08:48)


[관련제품]
http://www.icellsci.com/bbs/board.php?bo_table=Event&wr_id=36
첨부파일 내려받기 내 세포 건강지키기.jpg (287 KB)
아이셀 (2015-12-16 21:16)


[나만의 노하우]
DMSO가 세포에 damage를 크게 주는 경우가 있다고 종종 보고가 된다고 학부시절 지도교수님께 들어서 아예 DMSO는 사용을 안하고 있어요. 그냥 100% FBS로 cell을 얼리는데, 이 때도 온도를 천천히 내리는 것이 cell의 viability에 좋다고 하더라구요. isopropanol tank가 있는 경우에는 -24도까지 overnight 한 후 -70도 냉동실에서 하루, 그리고 액화질소 통에 넣고, tank가 없는 경우에는 -20도 냉동실에서 6시간, -70도 냉동실에서 overnight 한 후 액화질소 통에 보관합니다 :-)
알 Carolinie (2015-12-16 16:49)


[기본원리]
보통 DMSO와 같은 동결 보호제를 사용해서 cell pellet을 얼리는걸로 알고 있습니다.
지금 제가 사용하는 방법은 glycerin과 skim milk를 혼합하여 cell과 1대1로 섞어 사용하고 있습니다.
어느 실험실에서는 skim milk만 사용하는곳도 있다고 하더군요..
동결을 위해서는 glycerin만 사용하시는것도 추천 드립니다.
물에 녹기 때문에 어차피 wash 작업이나 계대를 한번 더 해서 사용하신다면 충분히 씻겨지니 다음 실험에 문제가 생기거나 하지는 않을것이라 생각 됩니다.
오나전흑마 (2015-12-16 13:32)


[기본원리]

세포를 얼릴때 가장중요한것은 천천히 얼리는것 (분당 1도씩내려가게)입니다.
그리고 배지조성도 중요합니다.
연구실에서 간단하고 안전하게 할수있는 cell stock법을 간단히 알려드리겠습니다.

동결배지조성: 50% culture media, 40% FBS, 10% DMSO

1. 충분한 수의 세포를 동결배지로 suspension한 후 1 mL씩 cryo-vial에 넣는다.
2. Cryo-vial을 꼭 닫은후 연필로 label 한다.
3. 50 mL conical tube에 isopropanol을 채운다.
4. Cryo-vial을 isopropanol 들어있는 50 mL conical tube에 퐁당 넣는다.
5. 50 mL conical tube를 꼭 닫은후 -70''C freezer에 하루정도 보관한다.
6. 다음날 50 mL tube에서 Cryo-vial을 꺼내서 liquid nitrogen tank에 넣어 보관한다.

이렇게 하시면 일반적인 세포들은 1년이상 건강하게 보관할수있습니다.

흠..님글 발췌

올챙이 BRIC (2015-12-16 11:43)


[기본원리]

일반적으로 세포주인 경우 -70도에서 보관시 약 6개월까지는 크게 문제는 되지 않습니다.
간혹 1년간 보관도 괜찮은 경우도 있긴 하지만, deepfreezer를 자주 여는 경우에는 이 기간보다 더 짧아질 수도 있습니다. 그리고, 몇몇 약한 세포나 Transfection을 위한 세포인 경우에는 LN2 보관을 해야 합니다.

어쩌구저쩌구님글 발췌

올챙이 BRIC (2015-12-16 11:41)

#cell freezing
 
#세포동결
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본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
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