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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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프로토콜 PCR과정에서 발생하는 contamination을 방지하는 방법은???
jaebum75  |  2015.10.15 10:55
PCR과정에서 발생하는 contamination을 방지하는 방법은??? PCR은 굉장히 민감한 반응이기 때문에 contamination에 취약합니다. PCR을 시행할 때 contamination을 방지하는 방법은 어떤 것이 있을까요?
cross contamination, carry-over contamination, 실험기자재, 실험실 환경 등등의 여러 부분에서 contamination을 줄이는 노하우를 공유해 주세요.


제안자  jaebum75  (2015.10.15)


(본 자료는 예전 실험Talk에서 이관되었습니다.)


[기본원리]
기본적으로 환경적인 영향에서만 오염이 된다고 생각하시겠지만...

Taq polymerase가 E.coli 안에서 배양후 분리하게 되는 과정에서 E.coli의 DNA가 같이 딸려오게 되어

있습니다. 그래서 완벽하게 분리할수 있는 Taq polymerase가 개발되었는데...

DNA Free taq polymerase라고 합니다.

조금더 확실한 PCR 기법이 될수 있을것 같네요.

문의전화 070-7768-1097
엘림바이오 (2015-10-26 09:21)


[관련제품]
DNA AWAY™ Surface Decontaminant는 유리또는 플라스틱에 붙은 DNA 혹은 DNase를 샘플에 영향없이 제거한다. 오트클레이브보다 더 확실하게 제거할 수 있다.
http://www.thermoscientific.com/content/tfs/en/product/dna-away-surface-decontaminant.html#sthash.daXxIbu9.dpuf

Decontaminant Wipes (뽑아쓰는 형태/1통 25장)

surface decontaminant(250mL)

 Individually Wrapped Decontaminant Wipes  (개별포장 35장)
올챙이 jaebum75 (2015-10-23 19:36)


[기본원리]
PCR반응의 contamination반응을 막는 방법은 몇가지로 나눌수가 있습니다.
1) 환경적 측면
   실험실을 핵산추출하는 공간과 PCR하는 공간, 전기영동하는 공간을 확실히 분리해야 합니다
   어쩔수 없이 같은 공간을 써야 한다면 PCR작업대(크린벤치와 유사하지만 작은 크기)같은
   것을 설치하여 공간격리를 시켜야 합니다.
2) 시약
   모든 시약은 1회분씩 분주하여 동결시켜놓고 써야 합니다. 꺼내서 쓰고 넣고 하는 과정에 오염이 발생할수 있기때문입니다. 또한 enzyme,primer,dNTPmix, nuclease free water등 모든 시약은 Lot번호를 기입해두고 소분하여 사용한다면 전체 오염을 방지하고 어느 시약이 오염원인지 나중에 파악이 가능합니다. 특히 PCR실험시 worksheet만들어두고 사용한다면 보다 체계적인 관리가 되겠지요.
  3) 장비
   가장 중요한 장비는 바로 마이크로피펫입니다. 피펫은 사용전후마다 DNA나 RNA를 제거하는 전용 세척액(여러 회사에서 제품화되어 나옴)으로 팁이 부착되는 샤프트 부분과 이젝터부분을 꼼꼼히 닦아서 말려두고 될수록 UV 살균기등에 보관해두어 UV등으로 부착된 핵산을 불활화 시키는 과정을 실시하면 더욱 좋습니다. 제가 아는 어느 회사는 좀 심하지만 해마다 피펫을 교체한다고 합니다. 그정도로 예민하죠, 또한 피펫팁은 반드시 필터팁을 사용합니다. 에어로졸이 발생하여 피펫내부가 오염될수있기 때문이죠. 
  UV irradiator를 사용하고 PCR증폭산물을 UV처리한 뒤 전기영동을 하는 경우도 있다고 합니다. 그렇게 처리된 산물은 다시 재증폭이 잘 안될수 있겠죠 하지만 클로닝이나 다른 작업을 해야될경우는 사용못하겠죠
  4) 보조시약
UDG와 같이 증폭산물에 T부분을 U로 치환시키는 시약을 보조로 넣으면 재증폭을 원천 차단할 수 있겠습니다.
올챙이 jaebum75 (2015-10-15 18:05)


[기본원리]

PCR 산물은 또 다른 PCR반응의 template로 사용될 수 있으며 PCR의 고민감도 증폭은 간혹 이러한 오염으로 인한 palse positive를 도출하기도 합니다. 따라서 이전에 PCR했던 산물은 오염이 되더라도 쉽게 제거해 줄 수 있는 방식으로 carry-over contamination방지법이 개발되어 왔습니다.

가령 dUTP를 기질로 합성된 DNA는 UDG에 의해 잘려져 나가 PCR template로 사용될 수 없습니다. 만약 PCR반응의 어디선가 오염이 되었고 (buffer, 물, primer, sample 등등) 이전의 모든 반응이 dTTP대신 dUTP를 사용한 것이었다면 PCR반응을 하기 이전에 UDG를 처리해 주면 이전 반응의 오염물은 쉽게 제거될 수 있습니다.


-엘피스님글 발췌-

올챙이 BRIC (2015-10-15 11:20)


[기본원리]

PCR contamination은 또한 Genotyping하는 사람들의 최대 적입니다.
Carry-over(out?) Contamination 이라고 하는데 이것을 극복하기 위해서
1)작업공간의 분리 2)UDG등의 사용 3)기타등등의 방법이 있습니다.

-모르지만님글 발췌-

올챙이 BRIC (2015-10-15 11:19)


[관련제품]
upload image
(주)서린바이오사이언스 (2015-12-29 18:05)

#PCR
 
#contamination
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본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
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