실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
E.coli 에서 soluble 한 protein 정제를 잘하는 방법은 무엇일까요???
새소리 (비회원)
E.coli에서 soluble한 상태로 온전하게 단백질 정제 하는 일은 쉬운 일이 아닙니다. E.coli strain, 온도, Tag, sonication 조건, salt 농도 등등 많은 조건들에 대한 연구자 분들의 살아있는 지식을 올려 주셔요!!! 제안자 새소리 (2014.02.05) |
[기본원리] 제 경험상 E.coli 상에서 soluble protein으로 발현시키기 위해 제가 여태 해봤던 과정은... 1. 2nd culture의 cell 농도에 변화를 줄것.(IPTG를 넣기 전) -> cell density가 soluble로의 expression에 영향을 줄 수 있다는 논문을 참고하여 했던 방법이고.. 2. 시간별 발현 테스트 -> 일정 시간이 경과하면 자기가 내포하고 있던 soluble도 inclusion body가 되면서 발현양이 줄어 들 수 있습니다. 하지만 제 가 실험했던 단백질은 이런 경우가 많더군요. 3. 온도별 발현 테스트 입니다. -> 자기를 분열하기 위한 온도와 단백질 생산에 주력하는 온도가 다르다는 논문과 선임들의 경험상 이야기들을 들은적이 있습니다. 4. IPTG 농도별 test -> 사실은 이 방법을 가장 많이 쓰실꺼라 생각이 드는데, 발현 condition을 결정하는데 가장 먼저 하는 방법이 아닐까 하는 생각이 드네요. 오히려 농도가 떨어 질수록 soluble 쪽으로 가는 경향을 보였습니다. 5. fusion tag conjugation -> 단백질에 따라서 기타 화학적으로 정제와 folding을 자연스럽게 해줄 수 있는 퓨전 파트너 단백질 등입니다. 하지만 차 후, enzyme을 사용하여 제거해 주어야 하는 공정이 들어갑니다. 물론, 단백질 고유의 active를 유지할 수 있는 상황이라면 그냥 달고서 실험 하는 경우도 종종 있습니다. 5. buffer change -> 이유를 많은 분들이 알고 계시기 때문에 별다른 말은 필요 없을 것 같습니다. soluble로 발현되어도.. 단백질 고유의 PI나, 침전과 같은 이벤트가 발생할 수 잇으니까 화학적으로도 중요한 부분이 아닐까 싶습니다. lysis공정에서도 sonication을 좀더 젠틀하게 한다던지... freeze&throwing 을 한다던지.. 프렌치 프레서로 깨본다던지.. 모두 버퍼선정에서 출발 해야 하지 않는가 생각이 드네요. soluble한 정제는 엄청난 시간과 정성을 들여야 하는 줄 정제쪽을 하시는 분은 다들 아실꺼 라 생각합니다. 석사동안.. 이 업무를 주로 했으나.. case by case죠.. 바이러스성 단백질이냐.. 동물 단백질이냐.. 단순 펩타이드냐. 단백질 정제에 있어서. 가장 중요한건 Soluble보다.. 내 단백질의 특성을 잘 이해하고 보다 신속하게 refolding을 할것이냐.. 아니면 계속 조건을 찾아 스케일 업 할 것이냐를 결정하여 정제하는것이 가장 좋은 방법이라는 생각이 듭니다.. | |
|
[나만의 노하우] 저희 실험실의 경우에는 단백질의 solubility를 향상시키기 위해 다양한 tag을 시도해봅니다. 우선 tag의 위치가 중요하고요. N-term tag인지 C-term tag인지에 따라서 발현 자체가 되거나 안 되는 경우도 있고, solubility도 좋아지거나 안 좋아지는 경우가 있습니다. 두 곳 모두 시도해보시면 좋을 것 같습니다. Tag의 종류는, 저희 실험실의 경우 10His, CPD, MBP, GST, YFP, KSI, protein G 등 다양한 tag을 보유하고 있습니다. Tag이 바뀌어도 별 영향이 없는 경우도 있지만, 어떤 단백질은 특정 tag에서만 soluble한 경우도 있어서 최대한 시도해보는 편입니다. 위의 tag 중에서는 MBP(Maltose-binding protein)가 일반적으로 가장 좋은 solubility를 보여줍니다. 다만 MBP의 크기가 꽤 크기에(~45kDa) 이미 큰 크기의 단백질을 발현시킬 때에는 발현량이 적어져서 오히려 안 좋은 경우도 있고, MBP 자체가 solubility를 심하게 향상시키기 때문에 tag을 잘라내는 순간 insoluble해지는 경우도 있습니다. 목적에 따라서 tag을 자르지 않고 쓰는 경우도 있으니, 어쨌든 MBP tag을 가장 추천드리고 싶네요. 만약 binding partner가 있는 단백질이라면 binding partner를 함께 섞어서 깨거나 co-expression 시키는 것도 좋은 방법입니다. 단독으로는 folding이 안 좋으나, binding partner들이 folding이 안 좋은 부분을 안정화시켜주는 경우도 있으니까요. 실험 목적에 따라 쓸 수도 있고 쓸 수 없기도 하는 방법인데, IUPred나 secondary structure를 확인하고 flexible한 loop 부분을 truncation해서 construct를 짜는 것도 중요합니다. 구조가 이미 밝혀진 단백질이라면, enzymatic activity에 관여하지 않는, 표면에 노출된 hydrophobic한 residue들을 hydrophilic한 residue들로 mutation시켜보는 것도 solubility를 높이는 데에 좋은 방법입니다. Sonication은 특별한 조건이 따로 있다기 보단, 온도를 낮게 유지하면서 최대한 빨리 깨는 게 중요하다고 생각합니다. 저의 경우엔 pulse를 3초/9초로 주고요, ice bucket에 얼음과 물을 함께 넣어 줍니다. 얼음만 넣으면 비커 주변부 얼음만 녹아서 나중에 비커 주변에 얼음이 접촉하지 않는 경우가 생기거든요. 물을 넣어줌으로써 비커에 얼음물이 계속 닿게 할 수 있습니다. 열전달 효율을 높이기 위해서 비커 대신 스테인리스컵(보통 구내식당에서 쓰는)을 이용해도 좋다고 하네요. Salt는 저는 기본적으로 100mM NaCl을 이용하고요, solubility가 낮은 단백질들은 50mM~1M 까지 테스트를 해봅니다. DNA 혹은 metal-binding 단백질의 경우에 일반적으로 salt 농도가 solubility에 중요한 영향을 주는 것 같습니다. Salt 농도가 높아지면 DNA나 ligand가 떨어지게 되니까요. E.coli strain은 additional tRNA가 들어있는 녀석들을 기본으로 사용합니다. 일반적으로 yield가 더 많이 나오더라구요. Gene 자체를 codon-optimize해서 쓰는 경우도 있던데, 저의 경우는 이걸로는 재미를 본 적이 거의 없습니다. 돈만 엄청나게 들고.. 지금 생각나는 것은 이 정도네요. 도움이 되셨다면 좋겠습니다! | |
|
[나만의 노하우] E.coli에서 soluble 한 단백질을 활성형태로 정제할 수 있다는 것은 정말 축복(?)이라 감히 생각하는 바입니다. 대장균이란 놈은 기가 막히게도 우리가 넣어준 유전자를 마구마구 단백질로 만들어주는 기특한 녀석이죠 ^^:; 성격도 대게는 원만한 편이죠? 일단 모든 분들이 올려주신 것처럼 단백질 발현양이 충분하고 수용성이라면 정제는 문제가 되지않는다고 생각합니다만...일단은 주제가 정제를 잘하는 방법에 대한 내용이니 나름 저만의 노하우를 몇자 적어봅니다 1. E.coli strain 중요합니다 단백질의 종류에 따라 대장균의 종류를 가리는 단백질이 종종 있습니다 특히 사람유래 단백질의 경우에는 rare codon tRNA 가 포함된 것이 더 좋을 때도 있습니다 벡터의 종류를 파악하신 후 사용가능한 competent cell을 사용해보세요 2. Tag 단백질이 불용성이라면 tag을 점점 더 크기가 크고 soluble 한 쪽으로 옮기면 효과가 있긴 합니다만, 단백질 자체가 불용성인 경우 detagging 혹은 dialysis 조건에서 문제가 발생하기도 하니 주의하셔야 합니다(soluble 단백질은 사실 무슨 짓을 해도 안정적인데 말이죠~) 3. Salt 농도 제가 다루었던 단백질들은 대게 salt가 250~500 mM 수준에서도 단백질이 안정했지만, 또 어떤 것들은 오히려 너무 높은 salt 농도가 역효과를 주기도 했었습니다 그리고 reducing agent(b-mercaptoethanol, DTT), glycerol, salt 농도, pH(단백질의 pI Value 및 표면에 노출되는 잔기를 고려) 하셔서 준비하셔야 합니다 단백질도 사람처럼 개개인의 특성이 다 다르다는 점을 꼭 기억하세요 그외 불용성을 soluble 하게 하려면 단백질 발현 온도를 완전 낮추어 보세요, 보통 16~18도, 혹은 10도, 저는 심지어 4도에서 1주일간 induction 해서 단백질 건진적도 있었습니다 또 배지에 Sorbitol/Betain을 이용해서 대장균에서 단백질을 soluble 하게 만들어준 논문도 있으니 찾아보시기 바랍니다 많은 분께 도움이 되길 바래봅니다 또한 이건 어디까지나 제 경험에 의거한 굉장히 주관적인 방법이니 너무 맹신마시고 참고하세요 ^^ | |
|
[기본원리] 콩셰님 의견에 일부 의문점을 갖습니다. 제 경험상 soluble로 가는 protein은 잘 깨졌을 시 투명하고 점도 또한 약해졌습니다. Lysis buffer에 어떤 물질을 첨가했는지는 잘 모르겠지만 Nacl과 Tris만을 넣은 기본 lysis buffer에서는 말이죠. SDS로 확인하였을 때 soluble form으로 가는 양이 많으면 많을 수록 더욱 투명해졌고요. 지금도 cell을 깰때면 투명도를 보면서 아 이건 soluble protein이 조금이라도 있겠구나 하고 예상을 합니다. Cell이 잘깨지면 탁도가 높아진다는 것은 경험해보지 못해서 잘 모르겠네요. 또한 점도를 낮출려면 액체질소를 이용하여 한두번 얼렸다 녹였다는 반복해주면 됩니다. | |
|
[기본원리] 1. 클로닝 벡터선정시 Active site 가까이에 Tag 이 달리ㅈ지않도록 sequence상으로 구조상으로 (구조가없다면 기존 논문을활용해서) 확인 을 하여야 합니다. 예를들어 내 효소는 N term 에 active site가있다면 c term 이나 아니면 방해되지않는지 확인을 하고 risk 를 줄여주면 좋습니다 2. Sonication을 통해 cell을 깰때도 보통 중온효소일경우 10초 깨고 20초 쉬고 반복이 좋습니다 셀이잘깨지면 셀을 깨기 전보다 점도가 높아지고 탁해집니다 (셀내의 물질들과 희석되어) | |
|
[나만의 노하우] e.coli에서 soluble하게 단백질을 잘 정제하는 방법... 그 전에 soluble한 단백질이 많이 발현되는 조건이 더 중요하더라구요.. 단백질만 많다면.. 요것저것 다해보고 하면 되니까..^^ soluble한 단백질이 발현이 되었다면... 1. e.coli strain : 단백질의 순수분리에 중요합니다. e.coli strain에 따라 발현될 수 있는 대장균 단백질은 아무리 정제하여도 없어지지 않는 경우가 많더라구요.. 2. 온도는 기본적으로 4도를 유지하면 가장 좋지요 3. tag은 affinity를 하고 제거 할때 아주 중요합니다. portase에 의해 단백질이 쪼개지는 경우도 생기더라구요. 4. sonication은 절대적으로 낮은 온도에서 너무 긴시간은 피하여야 단백질이 안정합니다. 5. salt.. 아주 중요합니다. affinity column, ion, size분리 까지 salt의 농도에 따라 단백질이 침전이 생기거나 column에 붙지 않거나 하는 상황이 생깁니다. 농도를 아주 잘 잡아야 안정하게 단백질 정제가 가능합니다. 6. 버퍼, ph도 아주 중요합니다. 단백질의 pka를 보시고 잘 결정하시길... 7. 단백질이 불안정할 경우 DTT나 glycerol를 넣습니다. 그럼 조금 나아지더라구요. 여러가지들이 아주 많이 있습니다. 단백질의 조건에 따라..detergent, protease....선택이 아주 중요합니다. 8. 시간이 중요합니다. 빠른시간에 빨리 정제를 하여 실험하는 것이 놓칠 수 없는 중요한 점입니다. 제가 아는 것들을 주저리 적었습니다... 저의 개인적 실험법이었습니다.~ | |
|
Bio마켓 프리미엄