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질문 emsa도와주세요ㅠ
촙오  | 2008.05.07 00:52
답변있는 질문은 수정/삭제 불가(☞문의)
첨부파일 파일첨부: 2-41.jpg (202 KB)
이미지 첨부파일
처음으로 엠사시작하는 초보 석사생입니다;

mitf라는 transcription factor와 m-box라는 promoter사이의 binding을

보려고 하는데요...

사진에서 맨 왼쪽 밴드가 stimuli하지 않은 쪽이구요,

나머지 오른쪽부터 다섯개까지가 stimuli하고 시간대별로 sampling한 것입니다.

예상대로라면 왼쪽밴드가 젤 흐리고 오른쪽부터 진해지는 양상을 보여야하는데

전혀 경향이보이지 않습니다ㅠㅠ

두밴드중에 어떤 밴드가 제가 원하는 밴드인지도 알 수 없구요ㅠㅠ

실험은....

우선 올리고머는 바이오니아에서 ssDNA두개 받아서

바이오니아에서 제공하는 dsDNA합성용 buffer로 100 pmole로 녹이고

두개를 같은 volume으로 섞고

90도에서 2분, 37도에서 1시간 두었습니다.




probe는

t4 polynucleotide kinase 10x 1ul
ds DNA oligonucleotide 2ul
r-32p ATP 1ul
kinase buffer 10x 1ul
DW 5ul

저렇게 넣고 4도에서 십오분 뒀구요

십오분후 0.5M EDTA 1ul랑 TE 89ul넣었습니다.

protein은 핵분획으로 5ug 넣었구요

protein+DW 7ul
5x binding buffer 2 ul 넣고 37도에서 십분뒀고

각 sample에 위에서 만든 probe를 1 ul씩 각각 넣고 RT에서

10분 두었습니다.

comb 에 각 10 ul씩 loading 해주었고

loading dye는 넣지 않고 양쪽 끝 빈 well에만 넣었고

pre running 한시간 정도 했습니다....



몇 번 반복했지만 계속 저런식으로 질질 끌리는 밴드만 얻고 있습니다.

그래서 probe제작시에 oligo를 뺀채로 만들어서 같은 조건으로 실험해봤는데

유사한 결과를 얻었습니다...

저 결과로 미루어볼때 제 생각엔 probe와 protein간의 complex가

이루어지지 않은것이라고 생각되는데....

probe제작시나 protein과 probe binding시에 incubation 온도가 complex형성에

영향을 주는 factor인지 궁금합니다.

만약 그렇다면 어느 온도에서 incubation해야 하는지도 궁금하구요...





저 저거 안되면 졸업 못해요ㅠㅠ

고수분들의 많은 조언 부탁드리겠습니다.
#emsa
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
꽃개구리아라곤  |  2008.05.07   
제가 mitf라는 단백질에 대해서 잘 모르지만, 그냥 상식적인 생각에서 답변을 좀 해보자면,
1. m-box라는 motif가 mitf라는 TF에만 specific한 sequence인지 하는 점이 좀 의심스럽습니다. 지금 실험조건에서는 cell의 nuclear fraction을 통채로 사용한 것 같은데 그렇다면 많은 TF나 DNA binding protein들이 섞여있는 상황일 것이므로 저렇게 지저분하게 끌려나오는 것이 당연하지 않나 싶습니다.

2. 핵 내의 단백질 중에서 mitf가 어느정도나 되는지 알고 계시는지 모르겠군요-저는 모릅니다만- 저런 현상이 단순히 mitf의 양이 적어서 나올 수도 있을 것 같습니다.

3. stimulus에 의해 mitf의 양이 늘어난다고 예상하시는지 혹은 mitf의 DNA binding affinity가 늘어난다고 생각하시는지 모르겠습니다만, 전자라면 emsa가 아니라 Western으로 보이면 될 듯하고, 후자라면 mitf를 IP한 후에 emsa를 해야하지 않을까 싶습니다.
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