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저도 FACS 실험의 전문가가 아니지만 도움이 될까 싶어 댓글을 달아봅니다
일단 패턴으로 보아, compensation이 잘못 잡혀있는 것 같아요
그 증거로는 apoptosis가 나타나는 위치 (1/4분면 자리)에 꼬리처럼 사선으로 나타나게 되는데,
그 경우 FL2-FL1%를 조절해주면 나아집니다
보통 저의 경우 50% 내외의 수준으로 compensation을 잡아요
이 점을 감안하고 보더라도 control cell에 약간의 damage는 있는 것으로 보여집니다
사실 이 점만으로 trypsin 처리에 의한 damage라고 판단내리기는 어렵습니다
실험진행시 세포 상태에 따라서도 달라질 수 있는 점이니, 실험 진행전에 충분히 세포를 잘 관찰하기를 권장드려요
Control에서도 문제가 나온다면 실험 과정중에 의심할만한 지점에서 cell을 뽑아서
trypan blue를 이용해서 biability를 가늠해보시는게 어떨까 합니다.
예를 들면 트립신의 적절하지 못한 처리로 데미지를 입었나 의심이 되시면
트립신 처리후에 trypan blue를 이용해 현미경으로 관찰을 해보시는 겁니다.
이상 부족한 답변이었습니다. 수고하세요
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레벨3
fluhyun
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17.01.13 15:45
일단, 위에 말씀하신 것처럼 compensation 이 덜 된것으로 보입니다.
adherent cell 의 경우 trypsin 처리로 cell 을 떼어내는 과정에서 damage 를 입게 되고 그로인해 annexin V 의 형광이 control 에서도 증가하게 나타나는 경우는 흔한 일입니다. 그래서 Annexin V/PI 실험의 경우, trypsin 보다는 mild 한 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
또한 cell 마다 차이는 많이 있겠으나, 보통은 control 에서 PI 의 증가량이 크지 않은데, 꼬맹이님의 FACS data 에서는 PI 의 증가자체가 크게 보입니다. 또한 제일 첫 그래프인 FSC/SSC 의 그래프를 보시면, 동일 cell 의 경우 비슷한 size 와 density 를 가지기 때문에 비슷한 FSC/SSC 를 가져서 하나의 population 을 형성하는데 꼬맹이님의 data 에서는 P1 이라 쓰여진 부분의 동그란 군집이외에 왼편으로 선을 그은것같은 군집이 하나 더 있는것이 보입니다.
아마 이부분의 cell 들이 없어진다면 annexin/PI 에서도 죽은 cell 들을 나타내는 부분들의 형광이 사라질것으로 생각됩니다.
cell 의 상태 자체가 좋지 않은 것인지, 실험 방법상에서 cell 이 damage 가 가해지는지 유심히 보셔야 할것 같습니다.