실험 Q&A Cell Biology > Cell Culture
이번에 differentiation과 Nitrite formation실험을 처음하게 됬는데요..
레벨1 서동주
제가 이논문 저논문 찾아가면서 직접 작성한건데요.. 처음이라 미숙한 부분도 많고 많이 어렵네요 ㅠㅠ 그래서 이실험 하고 계시는 고수님들께 부탁즘 드릴께요.. 아래에 protocol보시고 틀린부분이나 잘못된 부분즘 지적해주세요ㅠㅠ^ Differentiation Assay(3T3-L1세포 사용) 1. 세포를 10% NBS(newborn bovine serum)가 첨가된 DMEM배지를 이용하여 6well plate에 4×104cell/ml 농도로 분주한다. 2. 세포가 well의 100% confluence에 이르면 48시간 배양 후, 배지를 10% FCS(fetal calf serum)가 포함된 배지로 교체한 후 48시간동안 배양한다. 질문) 여기서 FCS대신 FBS를 사용해도 되나요? 3. 0.5uM DEX(dexamethazone), 500uM IBMX(1-methyl-3-isobutylxanthine), 10㎍/㎖ insulin을 첨가한 배지로 교체해준다. 배지와 각각의 농도의 소재는 2㎖씩 분주한다. 4. 2일에 한번씩 insulin만 포함된 배지로 교체 해준다. 5. 7일 동안 배양 한 후, cell harvest한다. Triglyceride assay 1. 7일 동안 분화 시킨 cell을 PBS로 세척 한 후, 0.1% NP-40(150㎕/well)이 포함된 PBS로 용해시킨다. 2. Triglyceride의 함량은 triglyceride GPO-Trinder kit(sigma)를 사용하여 측정한다. 3. 흡광도는 540nm에서 측정한다. 4. Triglyceride was normalized to protein concentration determined by the BCA protein assay with BSA(bovine serum albumin) as standard. 질문) 이부분을 어떻게 해석해야 되나요? Oil Red O staining 1. Cell을 PBS로 세척 한 후, 4% paraformaldehyde(pH7.4) 또는 10% formalin을 이용하여 30분간 고정시킨다. (1㎖/well) 질문) 어떤 논문은 paraformaldehyde을 사용했고 어떤논문은 formalin을 사용했던데 둘중에 어떤걸 사용해야 되는건가요? 2. 0.5% Oil Red O가 첨가된 60% isopropanol로 20분간 염색한다. 3. Oil Red O는 행궈서 제거하고, 37℃에서 말린 후, isopropanol을 첨가하여 cell에 남은 염료를 추출하고 510nm에서 흡광도를 측정한다. 질문) 마지막에 isopropanol을 넣고 흡광도를 찍으라는 건가요? Nitrite formation 1. 세포를 10% NBS(newborn bovine serum)가 포함된 RPMI-1640medium을 이용하여 96well plate에 2×106cells/ml 농도로 분주한다. 2. 24시간동안 incubation을 하여 세포를 well 표면에 부착시킨다. 3. serum이 들어있지 않은 RPMI-1640medium를 이용하여 3번 세척한다. 4. 각각의 농도의 소재를 30분 동안 전 처리 한다. 5. control에는 LPS(Lipopolysaccharide) 첨가하지 않고 실험군에 LPS를 첨가한다. 6. LPS첨가 후, 24시간동안 배양한다. 7. 세포배양액을 수거한 후, 배양액 100㎕에 Griess 시약 100㎕를 96well plate에 넣어 실온에서 10분간 암 조건에서 반응시킨다. 8. Microplate reader를 이용하여 550nm에서 측정 한다. 9. NaNO2를 희석하여 standard curve를 이용하여 생성된 NO의 양을 측정 한다.
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